ICS 71.100.70 C2682 Y42 上海日用 化学品行业协会 团体标准 T/SHRH 0 10-2018 _________________________________________________________________________________________ 化妆品 眼刺激测试 短时暴露试验 Cosmetics Eye irritation Test - Short Time Exposure Test 2018-12-01发布 2018-12-30实施 上海日用化学品行业协会 发布 1 目 次 前言…………………………………………………………………………… ……………… 2 1.范围…………………………………………………………………………… …………… 3 2.规范性引用文件 ……………………………………………………… …………… ……… 3 3. 术语和定义 ………………………………………… …………………… ………………… 3 4.原理………………………………………………………… ………………… …………… 3 5 .仪器与试剂耗材 ……………………………………… ………… ………………………… 3 6.试验方法 ………………………………………………………………………………… … 4 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准起草单位： 上海出入境检验检疫动植物与食品检验检疫技术中心、 上海家化联合股份有限公 司、伽蓝（集团）股份有限公司、 上海相宜本草化妆品股份有限公司 、上海中翊日化有限公司 、上海市 质量监督检验技术研究院 、玫琳凯（中国） 有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海清轩生物 科技有限公司 有限公司、 汉高（中国）投资有限公司、 广东博溪生物科技有限公司、 东阿阿胶股份有限 公司、上海日用化学品行业协会 。 本标准主要起草人： 张丽婷、卞俐娜、李小林 、陈田、吴建铭、吕智、 孙培文、 林艺青、 戴彦韵、 万向红、李琼、高宏旗 、金坚、陈亦华 3 化妆品眼刺激测试 短时暴露试验 1 范围 本标准规定了化妆品眼刺激性测试短时暴露试验方法。 本标准可作为 化妆品眼刺激性体外 试验方法。 本标准可作为眼刺激性评估体外组合方法之一。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 2285 化妆品体外替代试验实验室规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 眼刺激性 eye irritation 眼球表面接触受试样品后产生的可逆性炎性变化。 3.2 SIRC细胞系 statens seruminstitut rabbit cornea cell line 来源于兔眼角膜 组织的成纤维 细胞系。 3.3 STE试验 short time exposure test 采用SIRC细胞进行的 短时间暴露试验，本标准指 5 min暴露试验。 4 原理 本试验采用 兔角膜上皮细胞（ Statens Seruminstitut Rabbit Cornea ，SIRC），在96孔培养板培养， 测试样本暴露 5min，然后去除。 采用CCK-8细胞毒性测试法（ cell counting kit -8 cytotoxicity test ） 定量检测细胞存活率。暴露 后的细胞与 CCK-8试剂反应，活细胞线粒体中的脱氢酶会将 CCK-8试剂还原成 橙黄色的 甲臜染料，存活细胞越多，被还原成的染料越多， 颜料颜色深浅与 存活细胞数目呈线性关系。 测定波长 450 nm时的吸光度值，计算细胞的生存率， 最终判断样品的眼刺激性 程度。 5 仪器与试剂耗材 5.1 仪器 5.1.1 II级生物安全柜 5.1.2 二氧化碳培养箱： 温度37 ℃±1 ℃，湿度 90 %±5 %，5 %±1 % CO2浓度。 5.1.3 恒温水浴箱： 温度37 ℃±1 ℃。 5.1.4 倒置显微镜 5.1.5 酶标仪 4 5.1.6 电子天平 ：0.1 mg量程。 5.1.7 细胞计数仪或血球计数器 5.1.8 离心机 5.1.9 混悬仪 5.1.10 真空吸液泵 5.1.11 液氮罐 5.1.12 5 µL~50 µL，10 µL~100 µL，20 µL~200 µL量程排枪 5.2 试剂耗材 5.2.1 MEM培养基（ minimum essential medium ） 5.2.2 胎牛血清 （FBS）：56 ℃加热灭活 30 min。 5.2.3 0.25 % 胰酶/EDTA 溶液（Trypsin/EDTA ）：0.25 % 胰酶溶液与0.02 mol/L EDTA 溶液1:1混 均。 5.2.4 生理盐水： 0.9 % 氯化钠。 5.2.5 青霉素/链霉素双抗： 工作溶液 青霉素（ 100 U/mL）、链霉素（ 100 µg/mL）。 5.2.6 MEM完全培养基：含 10 % FBS 、100 U/mL 青霉素、 100 µg/mL链霉素。 5.2.7 二甲基亚砜（ DMSO） 5.2.8 细胞冻存培养基：含 20 % FBS 、10 % DMSO 的MEM培养基。 5.2.9 磷酸盐缓冲液（ PBS） 5.2.10 矿物油：细胞培养级 。 5.2.11 0.1 %十二烷基硫酸钠（ SDS）：称取0.01 g SDS 于10 mL无菌试管中 ,加入PBS至10 mL。 5.2.12 5 %吐温20（TWEEN 20 ）：称取0.5 g TWEEN 20 于10 mL无菌试管中 ,加入PBS至10 mL。 5.2.13 CCK-8试剂 5.2.14 10 mL 、50 mL无菌离心管 5.2.15 无菌吸管（ 5 mL,10 mL ） 5.2.16 细胞培养瓶及培养板： 25 cm2、75 cm2培养瓶； 96孔平底细胞培养板。 6 试验方法 6.1 基本要求 试验过程应符合 SN/T 2285 标准的要求。 为保证溯源性， SIRC细胞应由有资质的细胞库提供，选择 25代内的细胞进行试验。保证细胞培养的环境条件符合要求， 所有细胞培养相关操作步骤应 在生物安全 柜内进行，确保无 菌操作。 6.2 细胞培养 6.2.1 SIRC细胞培养 5 采用MEM完全培养基 （含10 % 胎牛血清， 2 mM L-glutamine ，50-10 unit/mL 青霉素和 50-100 µg/mL 链霉素），在 37 ℃±1 ℃，湿度 90 %±5 %，CO2浓度5.0 %±1 %条件下进行培养（ 后续试验 细胞培养 均按此条件 ）。 6.2.2 SIRC细胞培养 传代 每3 ~4 d按1:3或者1:4的比例进行传代培养 。弃培养基，加适量 PBS洗涤1次，加入 0.25 %胰酶/EDTA 溶液（25 cm2培养瓶0.5 mL,75 cm2培养瓶1 mL）进行消化 ,尽量使胰酶覆盖培养瓶的整个底面，在 倒置 显微镜下观察， 待细胞变圆脱壁，立刻加入 2 mL~3 mL MEM完全培养基终止消化，用无菌吸管轻轻上下 吹打使细胞分散均匀，加入培养基， 将细胞分到 3~4个新细胞培养瓶中， 放入二氧化碳培养箱培养。 复 苏后的细胞 至少需要盲传 2~3代待细胞状态稳定后才可以开始试验 。 6.2.3 SIRC细胞冻存 和复苏 按常规方法进行。 在 50 mL无菌离心管中配制冻存培养基见 5.2.8， 冻存密度为 1×106/mL~5×106/mL， 可以使用程序降温仪进行。复苏时，快速取出含有细胞的冻 存管，在 37 ℃水浴锅中快速融化后，转移 入有完全培养基的培养瓶， 放入二氧化碳培养箱培养。 待细胞贴壁后，马上更换完全培养基。 6.3 STE眼刺激性试验 6.3.1 细胞接种 取6.2.1中稳定生长状态的细胞 ，调整细胞浓度至 1×105 个/mL,以每孔100 µL接种到96孔细胞培养 板中（除最外周孔及空白对照孔） 。在细胞培养板的最外周孔中加入 200 µL PBS，以减少培养基的蒸发。 置二氧化碳培养箱中， 37 ℃±1 ℃，湿度 90 %±5 %，CO2浓度5.0 %±1 %条件下进行培养 。3天后， 观察细胞，如细胞融合达到孔底面积的 80％以上， 且状态良好，可进行下一步试验 。 6.3.2 样品制备 样品在试验前需要预先测试其溶解性。按优先次序选择溶剂：生理盐水、含 5 ％DMSO的生理盐水、 细胞培养级矿物油。 经测试后， 确定受试样品溶剂， 确保样本以稳定悬液 /或溶解状态保持在溶剂中 5min 以上。 在暴露试验开始当天制备样本。在 10 mL无菌试管中配制 0.5 %浓度的受试液体。溶剂经过无菌处理， 尽量保持无菌操作。 6.