ICS 71.100.70 C2682 Y42 团 体 标 准 T/SHRH 023-2019 ________________________________________________________________________________________ 化妆品屏障功效测试 体外重组 3D表皮模型 测试方法 Skin barrier efficacy test of cosmetics - In vitro reconstructed human skin test method 2019-12-30发布 2020-01-30实施 上海日用化学品行业协会 发布 T/SHRH 全国团体标准信息平台 T/SHRH 023-2019 1 目 次 前言…………………………………………………………………………………………… 2 1．范围………………………………………………………………………………………… 3 2. 规范性引用文件 ………………………………………………………………………… 3 3. 术语、定义 ……………………………………………………………………… ……… 3 4. 试验原则 ………………………………………………………………………………… 3 5. 试剂及仪器设备 ………………………………………………………………………… 3 6. 试验步骤 ………………………………………………………………………………… 4 7. 结果计算 ………………………………………………………………………………… 5 8. 质量控制 ……………………… ………………………………………………………… 5 9. 结果判定 ………………………………………………………………………………… 6 附录A： 资料性附录 …………………………………………………………………………… 7 全国团体标准信息平台 T/SHRH 023-2019 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准的某些内容可能涉及专利，本 标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准起草单位：广东博溪生物科技有限公司、上海家化联合股份有限公司、上海上美化妆品有限 公司、上海创元化妆品有限公司、福建片仔癀化妆品有限公司、东阿阿胶股份有限公司、上海绿瑞生 物科技有限公司、云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、 上海日 用化学品行业协 会。 本标准主要起草人： 李潇、张艳云、韩波、曹平、陈田、 陈静、聂菁 、曾四立、吴梅芳、 陈贞明、 谢阿贵、廖峰、姜春鹏、赵奕竹 、马骁、王飞飞、 李琼、金坚、陈亦华。 全国团体标准信息平台 T/SHRH 023-2019 3 化妆品屏障功效测试 体外重组 3D表皮模型测试方法 1 范围 本标准规定了 一种基于体外重组 3D表皮模型的 化妆品原料 及成品的屏障 功效测试 方法。 本标准可作为化妆品 屏障功效测试替代方法之一 ，也可结合其他方法对化妆品 屏障功效进行评价 。 本标准适用于具有屏障提升作用的化妆品 原料及驻留型化妆品 成品的屏障功效性 测试，不适用于 洗去型化妆品。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的 应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27830 -2011 化学品 体外皮肤腐蚀 人体皮肤模型试验方法 化妆品安全技术规范 3 术语、定义 3.1细胞活性 cell viability 测定细胞群体总活力的指标 [如细胞线粒体脱氢酶还原活性染料噻唑蓝（ 3-（4，5-二甲基噻唑 -2） -2，5-二苯基四氮唑溴盐， MTT）的能力 ]，指标的测定取决于 试验终点和所用的设计方案，并与细胞 总数和活性细胞数量有关。 3.2半数有效时间 median effective time ，ET50 待测物在固定浓度下导致细胞存活率降低 50％所需的暴露时间。 3.3吸光度 optical density, OD 入射光强度与透射光强度之比值的常用对数值。表示被检测物吸收的光学密度。特定波长下，同一 种被检测物的浓度与被吸收的能量成正比关系。 4 试验原则 4.1 本标准使用的体外 重组 3D表皮模型（ EpiKutis®），具有表皮的复层化结构（基底层、棘层、颗 粒层和角质 层）和屏障功能。 刺激物十二烷基硫酸钠 （SLS）接触模型，造成皮肤屏障与模型组织的 损伤。 4.2 屏障提升功效是通过一系列的物理、生物化学的作用，提升皮肤活细胞层与角质层的结构功能， 达到提升皮肤屏障功能的作用。 ET50值表征皮肤耐受外源刺激物的能力 ，以此评价待测物对皮肤屏障 的提升作用 。 5 试剂及仪器设备 5.1试剂和材料 5.1.1 体外重组 3D表皮模型（EpiKutis®）。 全国团体标准信息平台 T/SHRH 023-2019 4 5.1.2 体外重组 3D表皮模型培养液 （EpiGrowth 培养液）。 5.1.3 磷酸盐缓冲液（ PBS）。 5.1.4 Triton X -100 (1%，V/V)。 5.1.5 MTT（CAS No.298 -93-1）。 5.1.6 异丙醇。 5.1.7 阴性对照： 十二烷基硫酸钠 （0.2% SLS ）。 5.1.8 阳性对照： WY14643 （PPAR α激活剂）。 5.2仪器和设备 5.2.1 移液器： M25活塞排代式移液器 及相应吸头 ，20μL~200μL 、100μL~1000μL 移液器及相应吸头 。 5.2.2 CO 2培养箱： 37℃±1℃，（ 5±1）%CO 2，95%相对湿度。 5.2.3 酶标仪： 570nm。 5.2.4 超净工作台 。 5.2.5 水平振荡仪 。 5.2.6 分析天平（精度 0.1mg）。 6 试验步骤 6.1对照设置 试验需设置空白对照 组、阴性对照组 、阳性对照组 和待测物组， 每组 9个模型。（ ET50测定中设 置了 3个时间点，每个时间点 3个模型重复，总计 9个模型）。 6.2测试准备 阴性对照与阳性对照的工作液按照附录 A配制。 6.3待测物预处理 吸取 200µ L SLS 溶液（0.4%）和200 µ L待测物置于 1.5m L 离心管中，旋涡混匀 。 6.4模型准备 根据试验组别及模型数量，准备 6孔板，并在相应孔中添加 0.9mL的EpiGrowth 培养液。 6.5给药 化妆品成品给药方式 对阴性对照 组和阳性对照组， 吸取 25μL SLS溶液（0.2%）涂抹于模型表面 。对待测物组，吸取 25μL预处理后的 溶液涂抹于 模型表面 。对阳性对照 组， 需在 EpiGrowth 培养液中添加 50μM WY14643 。 空白对照组不进行给药处理。 给药结束后， 将 6孔板转移到 CO 2培养箱中孵育 24h（37± 1℃、5± 1%CO 2、 95%相对湿度）。 化妆品原料给药方式 对阴性对照 组、阳性对照组和待测物组， 吸取 25μL SLS溶液（0.2%）涂抹于模型表面 。对待测 物组，需在 EpiGrowth 培养液中添加相应浓度的待测物。 对阳性对照 组，需在 EpiGrowth 培养液中添 加50μM WY14643 。 空白对照组不进行给药处理。 给药结束后， 将 6孔板转移到 CO 2培养箱中孵育 24h （37± 1℃、5± 1%CO 2、95%相对湿度）。 6.6清洗 全国团体标准信息平台 T/SHRH 023-2019 5 模型孵育培养结束后 ，开始清洗程序。用无菌 PBS溶液重复清洗模型表面 10次，去除 残留的待 测物。用无菌棉签轻轻拭去模型内、外残留液体 ，放入新标记的 6孔板中，并在 每孔中加入 0.9mL EpiGrowth 培养液，用于 ET50测定。 6.7 ET 50测定： 各组模型表面滴加 80µ L 1% TritonX -100，孵育时间设定为 0h，1h，3h，其中孵育时间设置为 0h 的模型，不进行给药。 模型孵育结束后，开始清洗程序。用无菌 PBS溶液重复清洗模型表面 10次，去除 残留的 TritonX -100。每个模型的清洗总时间控制在 1~2 min。 根据模型总数量准备 24孔板，并 向每孔加入 0.3mL 的 MTT工