团 体 标 准 T/YNBX024—2021 代替T/YNBX024-2020 饲料添加剂凝结芽孢杆菌的测定 MethodfordeterminationofBacilluscoagulansinfeeds 2021-02-03发布 2021-02-10实施 云南省标准化协会 发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/YNBX024—2021 I前  言 本标准按照GB/T1.1和《团体标准管理规定》给出的规则制定。 本标准由云南省标准化协会提出并归口。 本标准主要起草单位：昆明三正生物科技（集团）有限公司、云南师范大学生命科学院、临沂市布 恩饲料有限公司、中国农业大学动物科技学院、福建新正阳饲料科技有限公司、四川农业大学动物营养 研究所、青岛贝宝海洋科技有限公司、云南农业大学动物科学技术学院、海南大学、山东梵蓝科技有限 公司、昆明理工大学生命科学院、济南百鸣生物制药有限公司、西南大学荣昌校区水产学院、南京嘉泰 生物科技有限公司、华南农业大学食品学院、昆明爱科特生物科技有限公司、云南省饲料工业协会、佛 山市三水君威饲料厂有限公司、成都三旺农牧股份有限公司、广东恒兴饲料实业股份有限公司、深圳澳 华集团股份有限公司。 本标准主要起草人：李亚平、冯莲英、黄遵锡、于娟、王忠、林登峰、余冰、万雪、王磊、程志斌、 吴小易、郭海涛、林连兵、韩克学、郑宗林、刘凌云、方祥、罗荣华、陶冶、郑军、任花池、张海涛、 邓登、车丽涛、张文捷、王春羲。 本标准附录A为资料性附录。 本标准使用单位：主要起草单位及云南省标准化协会授权使用单位。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： --T/YNBX024-2020。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/YNBX024—2021 1 饲料添加剂凝结芽孢杆菌的测定 1范围 本标准规定了饲料添加剂凝结芽孢杆菌的测定方法。 本标准适用于饲料添加剂凝结芽孢杆菌的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析室验室用水规格和试验方法 GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3采样 应符合GB/T14699.1的规定。 4菌种的制备 按照GB/T20195进行试样的制备，自平板上挑取单菌落，划线转接培养于MRS改良培养基平板上， 40℃±1℃，培养48h±2h。从每一平板中选取至少1个良好分离的特征菌落，转接保存，进行形态 检验。 5形态检验 将挑选纯化的菌落做革兰氏染色，镜检。凝结芽孢杆菌细胞应为杆状，两端钝圆，有芽孢，端生。 6生理生化确证试验 6.1稀释液、培养基、试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸馏水或去离子水，或相当 纯度的水。 6.1.10.85%灭菌生理盐水 6.1.2革兰氏染色试剂：见附录A中附录A.1 6.1.3厌氧性测定培养基及试剂：见附录A中A.2 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/YNBX024—2021 26.1.4V-P实验培养基及试剂：见附录A中A.3 6.1.5硝酸盐还原培养基及试剂：见附录A中A.4 6.1.6淀粉水解培养基及试剂：见附录A中A.5 6.1.7明胶液化培养基：见附录A中A.6 6.1.8丙酸盐利用培养基：见附录A中A.7 6.1.9柠檬酸盐利用培养基：见附录A中A.8 6.1.10糖、醇类发酵培养基：见附录A中A.9 6.1.117%氯化钠培养基：见附录A中A.10 6.2确证结果 凝结芽孢杆菌菌落为扁平圆形，白色而有光泽，表面湿润、平坦，边缘不整齐。杆状，两端钝圆，有芽 孢，一般端生或端生，偶尔中生，在7%氯化钠中不生长，V-P测定阳性，硝酸盐还原部分为阳性，能从D-甘 露醇产酸，能利用丙酸盐者可判定为凝结芽孢杆菌。凝结芽孢杆菌与类似芽孢杆菌的鉴别特征见表1。 表1凝结芽孢杆菌与其它类似芽孢杆菌杆菌的鉴别特征 项目凝结芽 孢杆菌枯草芽 孢杆菌地衣芽 孢杆菌蜡状芽孢 杆菌坚强芽孢 杆菌迟缓芽孢 杆菌巨大芽孢 杆菌短小芽孢 杆菌 厌氧生长 + - + + - - - - V-P + + + + - - d + 硝酸盐还原 d + + + d d d - 淀粉水解 + + + + + + + - 明胶液化 - + + + + d + + 利用丙酸盐 - - + ND - - ND - 柠檬酸盐 d + + + - - + + 产酸D-木糖 d + + - d + d + L-阿拉伯糖 d + + - d + d + D-甘露醇 d + + - + + d + 7%氯化钠生长 - + + d + d d + 注：+：阳性，-：阴性；d:部分菌株为阳性；ND:未测定。 6.3活菌计数 6.3.1检验试剂与仪器 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸馏水或去离子水，或相当 纯度的水。 6.3.1.1稀释液 稀释液是用于稀释试样的溶液，本检测方法的稀释液为0.9%氯化钠和1‰的吐温80水溶液。配制完 成后，分装100mL至装有50g玻璃珠的250mL三角瓶中,分装9mL稀释液至规格为18mm×180mm（或 15mm×150mm）的试管中，121℃灭菌30min。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/YNBX024—2021 3 6.3.1.2培养基（每100mL培养基含有） 蛋白胨1g、酵母膏0.5g、葡萄糖0.5g（无需分开灭菌）、牛肉膏0.5g、无水氯化钙15mg、一水合 硫酸锰0.01g、氯化钠0.25g、L-半胱氨酸盐酸盐0.05g、番茄粉0.05g、琼脂粉2.5g。调节pH至5.2，121℃ 灭菌30min。 6.3.1.3实验仪器、设备 除微生物实验室常规器材及设备外，还应有满足以下实验条件的仪器和设备： a)恒温摇床：17℃±1℃； b)恒温培养箱：5-60℃，温度分辨率±1℃； c)无菌移液枪、无菌枪头：200μL、1000μL； d)pH计：精确到±0.1个单位； e)涡旋振荡器：转速600-3200r/min。 6.3.2实验步骤 6.3.2.1精确称量1.000g待测试样，注意称量时应该将称量勺过酒精灯火焰灭菌，称量纸不重复使 用，每个试样2～3个重复。 6.3.2.2将试样在无菌操作条件下，加入装有100mL稀释液的三角瓶中，摇床220r/min振荡30min， 做成10-2菌悬液。 6.3.2.3在无菌操作条件下将10-2菌悬液用移液器取1mL到装有9mL稀释液的试管中，重复操作逐 级稀释至所需稀释度。注意移液器吸取试样前要润洗枪头3次以上，加入试样后无需冲洗枪头，每递 增稀释一次，更换一个枪头，每个稀释梯度加入试样后要在涡旋仪上混匀30s再吸入到下一支试管内。 6.3.2.4估算试样中的菌含量，选取2～3个适当稀释度，吸取一定量菌悬液（计算长出菌落在30～ 300个），用培养基进行倾注培养，充分混匀后静置冷却凝固，每个稀释度3个重复。 6.3.2.5将凝固后的平板放入40℃培养箱中倒置培养48h左右，选取菌落数在30～300之间的平板 进行计数。 6.3.3活菌含量计算 6.3.3.1活菌含量按式（1）计算 1NLXA 式中：A——试样中活菌数，CFU/g； X——某一稀释度下菌落数量的平均值； L——转换系数（平板中加入的菌液体积转换为1mL时所对应的体积系数）； N——稀释倍数。 最终结果按照GB/T8170数值修约规则修约至整数。 6.3.3.2注意事项 6.3.3.2.18×109～10×109CFU/g凝结芽孢杆菌建议选择107（添加100μL）和108（添加1000μL） 两个稀释度进行倾注。 6.3.3.2.2倾注后应匀速、顺时针和逆时针交替摇动平板多次（不低于20次），勿将培养基摇出平板。 6.4杂菌率检测 6.4.1稀释液 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/YNBX024—2021 4同4.2.1.1。 6.4.2培养基（每100mL培养基含有） 同4.2.1.2。 6.4.3实验仪器 同4.2.1.3。 6.4.4实验步骤 6.4.4.1精确称量1.000g待测试样，注意称量时应该将称量勺过酒精灯火焰灭菌，称量纸不重复使 用，每个试样2～3个重复。 6.4.4.2将试样在无菌操作条件下，加入装有100mL稀释液的三角瓶中，摇床220r/min振荡30min， 做成10-2菌悬液。 6.4.4.3在无菌操作条件下将10-2菌悬液用移液器取1mL到装有9mL稀释液的试管中，重复操作逐 级稀释至所需稀释度。注意移液器吸取试样前要润洗枪头3次以上，加入试样后不冲洗枪头，每递增稀 释一次，更换一个枪头，每个稀释梯度加入试样后要在涡旋仪上混匀30s再吸入到下一支试管内。 6.4.4.4估算试样中的菌含量，选取2～3个适当稀释度，吸取一定量菌悬液（计算长出菌落在30～ 300个）至平板中，用涂布器涂开，需要涂干，每个梯度涂布3个平板，涂布器不能重复使用。 6.4.4.5将平板放入40℃培养箱中倒置培养48h左右，对不同形态的菌落进行计数。 6.4.5菌含量计算 菌含量按式（2）计算。 2NLXA 式中：A——试样中活菌数，CFU/g； X——某一稀释度下菌落数量的平均值； L——转换系数（平板中加入的菌液体积转换为1mL时所对应的体积系数）； N——稀释倍数。 最终结