ICS 11.220 B 41 MA 团体标准 T/CVMA 15—2020 新型冠状病毒 动物血清抗体双抗原夹心酶 联免疫吸附试验 检测方法 Detection of antibodies against SARS -CoV-2 by double antigen sandwich ELISA in animal sera 2020 - 5 - 20发布 2020 - 5 - 20实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 15—2020 1 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件涉及专利 。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、 国家兽用药品工程技术研究中心、 厦门大学、 国家 传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心 、洛阳普泰生物技术有限公司 。 本文件主要起草人： 顾小雪、邓均华、葛胜祥、逄文强、李廷栋、刘颖昳、魏巍、张硕、徐琦、刘 洋、孙杰、黄甜、郝丽影、王传彬、田克恭。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 15—2020 2 引 言 本文件的发布机构提请注 意，声明符合本文件时， 可能涉及 到新型冠状 病毒重组蛋白 S1抗原及双 抗原夹心 ELISA抗体检测试剂盒 相关专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性 和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他 愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可 直接免费使用 。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关 信息可以通过 以 下联系方式获得： 专利持有人 姓名：国家兽用药品工程技术研究中心 、洛阳普泰生物技术有限 公司 地址：中国（河南）自由贸易试验区洛阳片区 高新区华夏路 6号六号公社 1010室 请注意除上述专利外，本文件的某些内容 仍可能涉及专利。本文件 的发布机构不承担 识别这些专利 的责任。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 15—2020 3 新型冠状病毒动物血清抗体双抗原夹心酶联免疫吸附试验检测方法 1 范围 本文件规定了新型冠状病毒 （SARS -CoV-2）动物血清抗体双抗原夹心酶联免疫吸附试验检测方法 ， 包括技术原理 、试剂与材料、仪器与设备 、样品的采集与运输 、检测操作步骤、结果判定 和生物安全要 求等。 本文件适用于家畜、家禽、 经济动物、 野生动物、实验动物 、宠物等动物 血清中新型冠状病毒 抗体 的筛查检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性 引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 技术原理 采用双抗原夹心 ELISA反应原理，酶标板上包被 SARS -CoV -2重组蛋白 S1抗原，待检样品中的 SARS -CoV -2特异性抗体与包被的 SARS -CoV-2重组蛋白 S1抗原结合，加入含 辣根过氧化物 酶（HRP） 标记 SARS -CoV -2重组蛋白 S1抗原的酶标试剂进行温育。 当样品中存在 SARS -CoV -2抗体时， 形成 “包 被抗原 -抗体 -酶标抗原 ”复合物，复合物上连接的 HRP催化显色剂反应，生成蓝色产物，终止反应后 变为黄色。若样品中无 SARS -CoV-2抗体，则不显色。 5 试剂与材料 5.1 SARS -CoV -2重组蛋白 S1抗原，按照附录 A制备。 5.2 HRP标记 SARS -CoV-2重组蛋白 S1抗原，按照附录 B制备。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 15—2020 4 5.3 包被缓冲液， 按照附录 C.1制备。 5.4 磷酸盐缓冲液（ PBS），按照附录 C.2制备。 5.5 封闭液， 按照附录 C.3制备。 5.6 20倍浓缩洗涤液， 按照附录 C.4制备。 5.7 酶标稀释液， 按照附录 C.5制备。 5.8 显色剂 A液，按照附录 C.6制备。 5.9 显色剂 B液，按照附录 C.7制备。 5.10 终止液， 按照附录 C.8制备。 5.11 阳性对照， 按照附录 C.9制备。 5.12 阴性对照， 按照附录 C.10制备。 5.13 酶标板。 5.14 封板膜。 5.15 吸水纸。 5.16 铝箔袋。 5.17 干燥剂。 5.18 采血器（2 mL、5 mL、10 mL）。 6 仪器与设备 6.1 离心机。 6.2 真空包装机。 6.3 酶标仪。 6.4 洗板机。 6.5 分析天平 。 6.6 37℃恒温培养箱。 6.7 2℃～8℃冰箱。 6.8 ﹣20℃冰箱。 6.9 水浴锅。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 15—2020 5 6.10 单道微量移液器（ 0.5 µ L～10 µ L；10 µ L～100 µ L；20 µ L～200 µ L；100 µ L～1000 µ L）。 6.11 多道微量移液器（ 10 µ L～100 µ L；30 µ L～300 µ L）。 7 样品的采集与运输 7.1 样品要求 检测样品为动物血清 。动物血清应 澄清、透明，无溶血、无 污染。 7.2 样品采集 进行无菌采血。采 血时，每只动物使用一个 采血器，采血量不少于 1 mL。将血样倾斜放置于室温 中静置 2 h～4 h，待血液自然析出血清，必要时可低速离心（ 1000 g离心 10 min～15 min），分离血清 ， 56℃ 30 min灭活后备用。 7.3 样品的运输与保存 按照 NY/T 1948进行样品的包装和标识， 按照 NY/T 541进行样品的 运输。血清样品若在一周内检测， 可置 2℃～8℃条件下保存。若超过一周检测，应置于 ﹣20℃及以下冷冻保存。 8 检测操作步骤 8.1 配制洗涤液 将20倍浓缩洗涤液 用蒸馏水或去离子水 20倍稀释后备用。 8.2 包被 用包被缓冲液将 SARS -CoV -2重组蛋白 S1抗原稀释至500 μg/L，包被酶标板， 100 μL/孔，于37℃包 被2 h，再转移至 2℃～8℃包被 16 h～24 h。 8.3 包被后洗板 弃去包被液， 加入洗涤液 300 μL/孔，洗涤板孔 ，洗板 1次。弃去洗涤液， 在吸水纸上拍干。 8.4 封闭 每孔加入 150 μL封闭液，置于 2℃～8℃封闭 16 h～24 h。弃去封闭液，在吸水纸上拍干。 8.5 干燥 置18℃～26℃、相对湿度不高于 30%的条件下干燥 3 h～6 h。将抗原包被板装入铝箔袋中，同时放 入干燥剂 ，用真空包装机 抽真空密封 ，于2℃～8℃保存备用。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 15—2020 6 8.6 加样 分别在对应的检测孔中加入待测样品 100 μL。每板设置阳性对照 2孔，阴性对照 2孔，分别在相 应孔中加入 100 μL阳性对照 和阴性对照 ，同时设置空白对照 1孔。 8.7 样品温育 用封板膜封板后，置 37℃温育 30 min。 8.8 样品温育后 洗板 取出抗原包被板，揭掉封板膜， 弃去反应液。 加入洗涤液 300 μL/孔，洗涤板孔，共洗涤 5次。最 后一次洗涤后，将 抗原包被板在吸水纸上拍干。 8.9 加酶标试剂 用酶标稀释液将 HRP标记 SARS -CoV -2重组蛋白 S1抗原稀释至工作浓度 ，每孔加入 100 μL，空 白对照孔除外 。 8.10 酶标试剂 温育 用封板膜封板后，置 37℃温育 30 min。 8.11 酶标试剂温育后 洗板 取出抗原包被板，揭掉封板膜，弃去反应液。 加入洗涤液 300 μL/孔，洗涤板孔 ，共洗涤 5次。最 后一次洗涤后，将 抗原包被板在吸水纸上拍干。 8.12 加显色液 每孔先加入显色剂 A液50 μL、再加入显色剂 B液50 μL，轻轻振荡混匀， 37℃避光显色 15 min。 8.13 加终止液 每孔加终止液 50 μL，轻轻振荡混匀， 10 min内测定结果。 8.14 测定 设定酶标仪波长于 450 nm处检测各孔 OD值。 9 结果判定 9.1 试验成立条件 阳性对照 孔OD值均应≥0.40，且阴性对照孔 OD值均应 <0.10，否则试验无效。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 15—2020 7 9.2 结果计算方法 9.2.1 样品OD值按照公式（1）计算： 样品 OD值=样品孔OD值－空白对照孔 OD值……………………………… ……（1） 9.2.2 临界值（ CUT OFF）按照公