ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 25-2020 口蹄疫病毒 O型、A型和Asia1型分型荧光 RT-PCR检测方法 Real-time RT-PCR for detection of foot and mouth disease virus serotype O, A and Asia1 2020 -12-22 发布 2020 -12-22 实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 25 -2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所、中国动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：刘湘涛、何继军、林密、马维民、杨光、杨亚民、高鹏程、靳野、郑海学、郭 建宏、王传彬、刘玉良 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 25 -2020 1 口蹄疫病毒 O型、A型和Asia1型分型荧光 RT-PCR检测方法 1 范围 本文件规定了口蹄疫病毒 O型、A型和Asia1型分型荧光 RT-PCR检测方法的试剂、主要仪器设备、 操作步骤、结果判定 和注意事项 。 本文件适用于疑似口蹄疫 临床发病动物水泡皮、水泡液、反刍动物食道 -咽部分泌物（ O-P液）、 动物组织 和病毒培养物中口蹄疫病毒核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 18935 口蹄疫诊断技术 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂 4.1 总RNA提取试剂 4.1.1 无核酸酶水 ：将焦碳酸二乙酯（ DEPC）按 0.1%的量（ w/v）加入三蒸水中制备的无 DNA酶 和RNA酶水（按照附录 A.1配制）。宜使用商品化 无核酸酶水 。 4.1.2 Trizol裂解液：商品化试剂， 4 ℃保存。 4.1.3 三氯甲烷：分析纯，常温保存。 4.1.4 异丙醇：分析纯，常温保存。使用前预冷至 -20 ℃。 4.1.5 75%乙醇：无水乙醇（分析纯）与 无核酸酶水 按体积比 3:1配制而成。使用前预冷至 -20 ℃。 4.1.6 其他商品化 RNA提取试剂：可采用 其他商品化 RNA提取方法，如采用离心柱、磁珠法、自 动化核酸提取仪等提取 RNA，分别使用配套试剂。 4.2 Real-time RT -PCR试剂 2×一步 RT-PCR缓冲液、聚合酶 Ex Taq HS (5 U/µ L)、Prime Script 反转录酶混合液、 RNA酶抑 制剂（ 40 U/µ L）。 4.3 引物和探针序列 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 25 -2020 2 O型上游引物序列为： 5’-GCTCTTTCCCCACCAGTTCA -3’；下游引物序列为： 5’-TTGTACTGGTCGTAGCGGTTGA -3’；探针序列为： 5’-CGGACGAACATGACGGCGCACA -3’，其 5’端和3’端分别标记 FAM和BHQ。 A型上游引物序列为： 5’-TTGCACTTCATGTTTACTGGCT -3’；下游引物序列为： 5’-CGTGTCCCATTCTGCGTGG -3；探针序列为： 5’-ACGCCACCGGACACACCTGAGAA -3’，其 5’ 端和 3’端分别标记 CY5和BHQ。 Asia1型上游引物序列为： 5’-CCGACGGCTTCACACTGA -3’；下游引物序列为： 5’-AGAAGTAGTACGTCGCAGACC -3’；探针序列为： 5’-CTCACCCAGCCCAAGAGCACCC -3’，其5’ 端和 3’端分别标记 HEX和BHQ。 配制反应体系时， 3条上游引物、 3条下游引物和 3条探针分别等量混合，成为混合上游引物、 混合下游引物和混合探针。 4.4 阳性对照和阴性对照 4.4.1 阳性对照： 灭活后的 口蹄疫病毒培养物 ，-20 ℃保存备用 。 4.4.2 阴性对照： 可使用无核酸酶水 。 5 主要仪器设备 荧光 PCR仪（至少含 FAM、CY5和HEX三种荧光信号） 、组织匀浆器、高速台式冷冻离心机、生 物安全柜等。 6 操作步骤 6.1 样品采集 、保存 样品采集 和保存按照 GB/T 18935 进行。 6.2 样品处理 6.2.1 生物安全 要求：样品处理的实验室应符合 GB 19489。 6.2.2 组织样品处理：将采集的发病动物病料或组织，置组织匀浆器中充分研磨， 用0.04 mol/L PBS （pH 7.4）（按照附录 A.2配置）制成 1:5~1:10 组织悬液， 4 ℃浸毒 1 h，3000 r/min 离心 10 min，取 上清液备用。 6.2.3 水泡液、 O-P液样品处理：直接用于检测。 6.2.4 病毒培养物：病毒接种本动物、实验动物后的发病病料等组织样品，按照 5.2.2处理。病毒接 种细胞培养物直接检测。 6.3 病毒 RNA提取 6.3.1 若使用传统的 Trizol裂解方法提取病毒 RNA，参照以下步骤进行操作： a) 取已处理的待检样品、 阳性对照和阴性对照各 200 µ L， 分别置于 1.5 mL离心管中， 每管加入 1000 µ L Trizol 裂解液，充分混匀，室温静置 3 min~5 min。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 25 -2020 3 b) 在每管中加入 200µ L三氯甲烷 ，涡旋震荡 15 s，室温下放置 2 min~3 min后，4 ℃，12000 r/min ， 离心 10 min。 c) 吸取约 500 µL上层水相， 置于新的离心管中， 加入等量异丙醇， 充分混匀， 室温静置 15 min。4 ℃， 12000 r/min ，离心 10 min，小心倒干液体，留下 RNA沉淀。 d) 加1000 μL 75% 乙醇，颠倒洗涤沉淀， 4 ℃，10000 r/min ，离心 5 min，小心倒干液体，室温干燥 5 min ~10 min。 e) 在每管中加 20 μL 无核酸酶水 溶解 RNA。 提取的 RNA可立即用于荧光 RT-PCR反应， 也可 -70 ℃ 冰箱保存备用。 6.3.2 若使用其他商品化 RNA提取试剂盒，按说明书操作。 6.4 荧光 RT-PCR检测 6.4.1 反应液配制，采用 25 μL反应体系，扩增体系配制 见表 1。 表1 扩增体系 配制 2×一步 RT-PCR缓冲液 12.5 µ L Ex Taq HS (5 U/µ L) 0.5 µ L Prime Script RT Enzyme MixⅡ 0.5 µ L 混合上游引物 (10 µ mol/L) 0.5 µ L 混合下游引物 (10 µ mol/L) 0.5 µ L 混合探针（ 5 µ mol/L) 1 µ L 样品及对照 总RNA 2 µ L 无核酸酶水 7.5 µ L 总体积 25 µ L 6.4.2 扩增程序： 42 ℃反转录 15 min；95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火 30 s，40次 循环。探针检测设置 FAM、CY5和HEX三种荧光信号。在退火结束时收集荧光。 7 结果判定 7.1 分析条件设置 基线以荧光 PCR仪给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增 曲线的最高点为准 ，不同荧光 PCR仪可根据其噪音情况进行调整。 7.2 试验成立条件 阴性对照在 FAM、CY5和HEX通道检测无 Ct值且无特定扩增曲线， 阳性对照在 FAM、CY5和HEX 通道检测 Ct值≤25且有明显对数扩增曲线， 二者均成立才可判定 试验成立 ，否则试验无效 。 7.3 判定标准 结果判定时，对 FAM、CY5和HEX通道检测一一判定。 若FAM检测通道有对数扩增曲线， 且 Ct值≤30， 可判样品为口蹄疫病毒 O型核酸阳性； 若 Ct值＞30， 可判样品为口蹄疫病毒 O型核酸阴性。若 CY5检测通道有对数扩增曲线，且 Ct值≤30，可判样品为口蹄 疫病毒 A型核酸阳性；若Ct值＞ 30，可判样品为口蹄疫病毒 A型核酸阴性。若HEX检测通道有对数扩 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 25 -2020 4 增曲线，且 Ct值≤30，可判样品为口蹄疫病毒 Asia1型核酸阳性；若Ct值＞ 30，可判样品为口蹄疫病毒 Asia1型核酸阴性。若样品经扩增后， 有 2或3个检测通道同时有对数扩增曲线， 且 Ct值≤30， 应按照 GB/T 18935进一步复核。 8 注意事项 —实验室进行疑似口蹄疫样品检测，应 严格遵守我国生物安全 相关法律法规