ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 32-2020 禽白血病病毒抗原化学发光免疫分析检测 方法 chemiluminescent immunoassay for detection of avian leukusis virus antigen 2020-12-22发布 2020-12-22 实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 32-2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结 构和起草规则》 的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及 专利。本文件的发布机构不承担识 别这些专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：中国动物疫病预防控制中心、 新疆生产建设兵团动物疫病预防控制中心 、洛阳现 代生物技术研究院有限公司 、黑龙江省动物疫病预防控制中心、重庆市动物疫病预防控制中心、 新疆维 吾尔自治区动物疫病预防控制中心、西藏自治区动物疫病预防控制中心、广西壮族自治区动物疫病预防 控制中心、江西省动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：孙雨、王传彬、 顾小雪、马英、赵晓春、肖颖、 李秀梅、宋晓晖、 刘亚涛、张 旭、蒋菲、王睿男、杨林、 孙航、姚强、 央珍、刘近、杨晓帆、王文、林汉亮、邹联斌、甘平、 毕一鸣、 魏巍、张力、殷涛、 刘颖昳、徐琦、胡冬梅、 韦正吉、 刘明瑞、耿玉静、任雪建、吴彬、吕园园。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 32-2020 1 禽白血病病毒抗原化学发光免疫分析检测方法 1 范围 本文件规定了禽白血病病毒抗原化学发光检测试剂盒检测禽白血病病毒抗原的检测方法 的试剂与 材料、仪器与设备、技术原理、实验前准备工作、操作步骤、试验成立标准、结果判定标准等内容 。 本文件适用于禽类泄殖腔拭子、蛋清、胎粪样品中禽白血病病毒抗原的检 测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条 款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文 件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范执行。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂与材料 4.1禽白血病病毒 p27蛋白单克隆抗体， 按照附录 A制备 4.2 禽白血病病毒 p27蛋白酶标单克隆抗体， 按照附录 B制备 4.3 PBST（pH值7.2），按照附录 C.1配制 4.4 包被缓冲液， 按照附录 C.2配制 4.5 封闭液， 按照附录 C.3配制 4.6 酶结合物 稀释液， 按照附录 C.4配制 4.7 阴性对照， 按照附录 C.5配制 4.8 阳性对照， 按照附录 C.6配制 4.9 化学发光底物 A，按照附录 C.7配制 4.10 化学发光底物 B，按照附录 C.8配制 5 仪器与设备 化学发光免疫分析仪、分析 天平、洗板机、 37 ℃温箱、 2 ℃~8 ℃冰箱、﹣20 ℃冰箱、单道微量移 液器（ 0.5 µL~10 µL；10 µL~100 µL；20 µL~200 µL；100 µL~1000 µL） 、多道移液器（ 300 µL）、NUNC 反应板、血清稀释板（ 96孔一次性 U型血凝板或 96孔细胞培 养板） 、一次性注射 器（ 5 mL、10 mL）。 6 技术原理 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 32-2020 2 采用双抗体夹心反应原理，包被板上包被禽白血病病毒 2E5株单克隆抗体，待检样品中的待检抗原 和酶标记抗体形成固相抗体 -抗原 -酶标抗体免疫复合物，洗涤除去未结合酶标抗体，加底物显色来判定 样品中的抗原含量。 7 试验前准备工作 7.1 样本采集及处理 7.1.1 蛋清样品 取全蛋，破碎后取蛋清，置﹣ 18 ℃以下冻融 1次，用塑料吸头吸取蛋清直接进行检测。 7.1.2 泄殖腔拭子 用棉签于待检鸡只泄 殖腔取样后，放入 1mL样品稀释液中，置 ﹣18 ℃以下冻融 1次，恢复室温后， 剧烈振荡 1 min，挤出棉签中 的液体，弃棉 签。将液体于 2 ℃~8 ℃下，以 12000 r/min离心 1 min，取上清 直接进行检测。 7.1.3 胎粪样品 用棉签取待检鸡只胎粪，放入 1 mL样品稀释液 中，置﹣18 ℃以下冻融 1次，恢复室温后，剧烈震荡 1 min，挤出棉签中的液体，弃棉签。液体在 2 ℃~8 ℃下，以 12000 r/min离心 1 min，取上清直接进行检 测。 7.2 样本的保存与运输 样本若在一周内检测，可置 2 ℃~8 ℃条件下保存。若超过一周 检测，应置于 -20 ℃以下冷冻贮存。 运输时注意冷藏，确保样品有 效。采集的样本可用冰袋或保温 桶加冰密封等方式运输，运输时 间应尽量 缩短。应符合 NY/T 541 的规定。 8 操作步骤 8.1 包被 根据生产工艺的研究结果，用包被缓冲液将 2E5株单抗稀释至终浓度为 0.85 μg/mL制备包被液，将 包被液以 100 μL/孔加入发光板，置 冰箱 2 ℃~8 ℃包被 22 h~24 h。 8.2 洗板 弃去包被液，用 300 μL PBST洗涤板孔 ，洗板 2次。每次洗涤后应弃去孔内的液体。最后一次洗涤 液 弃去后， 将包被板 在吸水纸上拍干，直至孔内无残留洗涤液 。 8.3 封闭 每孔加入 150 μL封闭液，置 冰箱 2 ℃~8 ℃封闭 22 h~24 h。 8.4 干燥 弃去封闭液，在吸 水纸上拍干。置 35 ℃~37 ℃干燥 2 h~3 h，加入干燥剂，密封包装，置 2 ℃~8 ℃ 保存。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 32-2020 3 8.5 加样 取出 CLIA包被板（根据待检样品的多少，可将板条拆开分次使用），分别加入 100 μL阴性、阳性 对照，每次检测各加两孔；在相应的样品孔中加入 100 μL样品。 8.6 温育 贴上封板膜，置 37 ℃恒温培养箱中温育 29 min~31 min。 8.7 洗板 取出反应板，弃去反应 液。用 300 μL洗涤液洗涤板孔， 共洗涤 5次。每次 洗涤后应弃去孔内的液体。 在最后一次洗涤液弃去后， 将包被板在吸水纸上拍干，直至孔内无残留洗涤液 。 8.8 加酶结合物 每孔加入 100 μL酶结合物。 8.9 温育 贴上封板膜，置 37 ℃恒温培养箱中孵育 29 min~31 min。 8.10 重复步骤 7.7 8.11 加入底物 每孔各加入 50 μL的化学发光底物 A和50μL的化学发光底物 B，振荡混匀（也可 将化学发光底物 A、 B等比例混匀后加 100 μL）。 8.12 静置 在15 ℃~25 ℃条件下避光静置 5 min。 8.13 读值 静置后 15min内用化学发光仪读 取发光值。 9 结果判定 9.1 成立条件 阴性对照 平均值（ NC X） NC X =( NC1+NC2 )/2 阳性对照平均值（ PC X） PC X =( PC1+PC2 )/2 试验成立判断标准： PC X > 10 NC X ；否则，试验不成立。 9.2 结果判定描述 S/P=样品 /PC ，其中 S代表样本发光 值。 若S/P≥0.2，样品应判定为阳性； 若S/P＜0.2，样品应判定为阴性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 32-2020 4 附 录 A (规范性) 禽白血病病毒 p27蛋白单克隆抗体的制备 A.1 生产用细胞繁殖 从液氮中取出杂交瘤细胞 2E5株和 3D5株工作细胞，在 37℃水浴中迅速解冻，用含 20 %胎牛血清 的RPMI -1640培养液制成细胞悬液，置 37 ℃、含 5 % CO 2培养箱中培养 48 h～72 h，使其稳定分裂繁 殖，长成细胞单层。取长成良好单层的细胞 1瓶，弃掉培养基，用 10 mL含20%胎牛血清的 RPMI -1640 培养液吹悬细胞，按照 1∶3的比例接种到新的细胞瓶（ 75 cm2）中，然后补充含 20 %胎牛血清的 RPMI -1640培养液至 15 mL/瓶，置 37 ℃、含 5 % CO 2的培养箱中继续培养 48 h~72 h。 A.2 腹水的制备 将扩大培养的杂交瘤细胞以 1000 r/min离心 10 min，弃上清，用 RPMI -1640培养基重悬，细胞计数 板进行细胞计数，用 RPMI -1640培养基将细胞浓度稀释至 1.25× 107 个/mL。取 BALB/c小鼠，各经腹 腔接种杂交瘤细胞， 100 μL/只，观察 10 d~15 d，待小鼠 腹部明显肿大后，采集腹水。 A.3 腹水的纯化 采用辛酸 -饱和硫酸铵沉 淀方法， 对制备的腹水进行纯化， 纯化后的单克隆抗体无菌定量分装， -80 ℃ 以下保存备用。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 32-2020 5 附 录 B (规范性) 禽白血病 p27蛋白酶标单克隆抗体的