ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 35-2020 猪瘟病毒抗体化学发光免疫分析检测方法 chemiluminescent immunoassay for detection of classical swine fever virus antibody 2020-12-22发布 2020-12-22 实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 35-2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某 些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、洛阳现代生物技术研究院有 限公司、新疆生产建设兵团动物疫病预防控制中心、兆丰华生物科技（南京）有限公司北京生物医药科 技中心、北京亿森宝生物科技有限公司、江西省动物疫病预防控制中心、黑龙江省动物疫病预防控制中 心、重庆市动物疫病预防控制中心 。 本文件主要起草人： 孙雨、王传彬、王琴、李秀梅、宋晓晖、赵晓春、肖颖、王睿男、蒋菲、杨林、 刘奇、王美君、孙航、徐璐、 张旭、赵启祖、张乾义、夏应菊、姚强、甘平、马英、李晓 霞、毕一鸣、 王新杰、孙晓明、凌洪权、武煊、彭强、张力、殷涛、刘颖昳、徐琦、胡冬梅、吕园园、任雪建、杨晓 帆、邹兴启、朱元源、刘近、杨志、耿玉静。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 35-2020 1 猪瘟病毒抗体化学发光免疫分析检测方法 1 范围 本文件规定了猪瘟病毒抗体化学发光 免疫分析 检测方法 的试剂与材料、仪器与设备、技术原理、实 验前准备工作、操作步骤、试验成立标准、结果判定标准等内容 。 本文件适用于猪瘟病毒抗体的检测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期 的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范执行。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂与材料 4.1 猪瘟病毒 E2重组蛋白， 按照附录 A制备 4.2 猪瘟病毒单克隆抗体， 按照附录 B制备 4.3 酶结合物， 按照附录 B制备 4.4 包被缓冲液， 按照附录 C.1配制 4.5 PBS，按照附录 C.2配制 4.6 封闭液， 按照附录 C.3配制 4.7 酶结合物稀释液， 按照附录 C.4配制 4.8 校准品稀释液， 按照附录 C.5配制 4.9 校准品 1~校准品 6，按照附录 C.6~C.7配制 4.10 25倍浓缩洗涤液， 按照附录 C.8配制 4.11 化学发光底物 A，按照附录 C.9配制 4.12 化学发光底物 B，按照附录 C.10配制 5 仪器与设备 化学发光免疫分析仪、分析 天平、洗板机、 37 ℃温箱、 2 ℃~8 ℃冰箱、﹣20 ℃冰箱、单道微量移 液器（ 0.5 µ L ~10 µ L；10 µ L ~100 µ L；20 µ L ~200 µ L；100 µ L ~1000 µ L） 、多道移液器（ 300 µ L）、NUNC 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 35-2020 2 反应板、血 清稀释板（ 96孔一次性 U型血凝板或 96孔细胞培养板） 、一次性注射器（ 5 mL、10 mL）。 6 技术原理 采用竞争反应原理，包被板上包被 E2重组蛋白，待检样品中的特异性抗体和酶标记抗体竞争性结 合重组蛋白，待检样品中抗体剂量值的高低与发光信号值成反比，通过校准曲线拟合计算，即可得出待 检样品中抗体的剂量。 7 试验前准备工作 7.1 样本采集及处理 采集静脉血时，每只猪使用一个注射器。建议进行静脉无菌采血，不少于 2 mL。室温静置于斜面 2 h，待血液自然凝固后，置 2 ℃~8 ℃冰箱中放置不少于 2 h，4000 r/min离心 10 min。用移液器小心吸出 上层血清。 7.2 血清样本的 保存与运输 血清样本若在一周内检测，可置 2 ℃~8 ℃条件下保存。若超过一周检测，应置于 -20 ℃以下冷冻 贮 存。运输时注意冷藏，确保样品有效。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输时 间应尽量缩短。 应符合 NY/T 541 的规定。 8 操作步骤 8.1 包被 将重组蛋白用包被缓冲液稀释至 0.1 μg/m L，加入 NUNC反应板中， 100 μL/孔，置 37 ℃包被 3 h。 8.2 洗板 弃去包被液，用 300 μL PBST洗涤板孔 ，洗板 2次。每次洗涤后应弃去孔内的液体 。最后一次洗涤液 弃去后， 将包被板 在吸水纸上拍干 ，直至孔内无残留洗涤液 。 8.3 封闭 每孔加入 150 μL封闭液，置于 37 ℃封闭 2 h。弃去封闭液，在吸水纸上拍干。 8.4 干燥 置于 37 ℃干燥 3 h。装入铝箔袋，加干燥剂，抽真空，置于 2 ℃~8 ℃保存备用。 8.5 加样 取出抗原包被板。 每次实验需设置系列校准品 6孔。 首先在血清稀释板上依次加入校准品 1~6校准品 各60 μL，其余各孔依次加入待检样品各 60 μL，以上各孔 每孔再加入 60 μL 酶结合物，震荡混匀；每孔 吸取 100 μL转移至抗原包被板对应孔内。 8.6 温育 置37℃恒温培养箱中温育 29 min~31 min。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 35-2020 3 8.7 洗板 取出反应板，弃去反应液。用 300 μL洗涤液洗涤板孔，共洗涤 5次。每次洗涤后应弃去孔内的液体。 在最后一次洗涤液弃去后， 将包被板在吸水纸上拍干，直至孔内无残留洗涤液 。 8.8 加入底物 每孔各加入 50 μL的化学发光底物 A和50 μL的化学发光底物 B，振荡混匀（也可 将化学发光底物 A、 B等比例混匀后加 100 μL）。 8.9 静置 在15 ℃~25 ℃条件下避光静置 5 min。 8.10 读值 静置后，在 15 min内用化学发光仪读取发光值。 9 结果计算方法 以校准品 1至校准品 6的发光值为 纵坐标， 对应的抗体剂量值 （ 0 NCU/m L、10 NCU/m L、20 NCU/m L、 40 NCU/m L、100 NCU/m L、200 NCU/m L）为横坐标，通过 ELISACalc 软件绘制校准品的四参数拟合曲 线，四参数模式为 Y=(a -b)/[1+(x/c) *b]+d。将样本的发光值代入校准曲线计算，即可得出样品中猪瘟病 毒抗体的含量。 10 试验成立条件 将6个校准品的发光值与对应抗体剂量值进行四参数拟合， R2≥0.99，试验成立。否则，应重新检测。 11 结果判定 如果待测样品中抗体含量＜临界值 20 NCU/m L，样品判定为猪瘟病毒抗体阴性； 如果样品的抗体剂 量值≥20 NCU/m L，样品判定为猪瘟病毒抗体阳性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 35-2020 4 附 录 A (规范性) 猪瘟病毒 E2重组蛋白的制备 A.1 生产用毒种的繁殖 取生长良好的 Sf9细胞，将毒种按照约 1:100的比例感染贴壁细胞，约 72 h后待 70 %~80 %的细胞 出现 CPE（增大或裂解）现象时，将细胞吹打下来，所收集的病毒液，即为生产用毒种。 A.2 包被抗原 E2重组蛋白病毒液的制备 将Sf9细胞悬浮培养，初始接种密度应大于 5× 105个/mL，待细胞长至对数生长期时（细胞密度约 1× 106个/mL~2× 106个/mL） ，按 1%的比例接种生产用毒种，继续培养约 3 d后，观察细胞增大并将要裂 解之前，离心收集培养上清。 A.3 包被抗原 E2重组蛋白的纯化 将培养上清进行透析后，用阳离子交换柱纯化（ SP Sepharose Fast Flow ）进行梯度洗脱，收集含有 目标蛋白的组分， 0.1 mol/L pH9.0 的Tris-HCl缓冲液调节 pH值至 7.5，用His-tag柱亲和纯化 （ Ni Sepharose 6 Fast Flow ） ，收集目标蛋白组分，并用 PB（20 mmol/L PB ，150 mmol/L氯化钠， pH值7.0）透析，置 -70 ℃以下保存备用。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 35-2020 5 附 录 B (规范性) 猪瘟病毒 E2蛋白单克隆抗体的制备 B.1 猪瘟病毒 E2蛋白单克隆抗体的制备 B.1.1 杂交瘤细胞繁殖 1C8株杂交瘤细胞复苏后， 用含 15 %胎牛血清的 DMEM培养液制成细胞悬液， 置 37 ℃、含5 % CO2 培养箱中培养 5代。 收集每代次的细胞上清， 进行梯度稀释， 用包被猪瘟病毒 E2蛋白 （浓度为 0.25 µ g/m L） 的反应板进行检测，以 OD450nm 值≥1.0的最高稀