团体标准 T/CVMA 40-2020 乙型脑炎 病毒微滴式数字 RT-PCR检测方 法 Method of droplet digital RT -PCR for detection of Japanese encephalitis virus 2020-12-22发布 2020 -12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 ICS 11.220 B 41 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 40 -2020 1 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和 起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些 内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位： 上海市动物疫病预防控制中心 。 本文件主要起草人： 李鑫、王建、赵洪进、鞠厚斌、葛菲菲、杨德全、沈海潇、杨显超、刘健、 陶 田谷晟。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 40 -2020 2 乙型脑炎 病毒微滴式数字 RT-PCR检测方法 1 范围 本文件规定了乙型脑炎 病毒（Japanese Encephalitis Virus ，JEV）微滴式数字 RT-PCR检测的操作方 法。 本文件适用于猪脑组织、血液样本中乙型脑炎 病毒感染及疫苗免 疫核酸的 检测。 2 规范性引用文件 下列文件中 的内容通过 文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 数字 RT-PCR： 数字反转录聚合酶链式反应（ digital reverse transcript polymera se chain reaction ） BHQ1： 无荧光淬灭基团（ black hole quencher -1） FAM： 6-羧基荧光素 （6-carboxyfluorescein ） RNA： 核糖核酸 （ribonu cleic acid ） 5 原理 微滴式数字 PCR（Droplet Digital PCR ，ddPCR）的技术原理是利用微滴化技术将一份 反应体系 分成 数万个纳升级的微滴 进行定量 PCR检测，本质上 是将传统定量 PCR的一次检测变成数万次检测 ，提高了 检测的灵敏度和精准度。微滴发生器 可以将每一份扩增体系 分成数万个均匀的纳升级微滴，每个微滴不 含或者含 有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都 将作为一个独立的 PCR扩增体系，在 PCR扩增仪上 进行终点 PCR扩增。利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为 1，没有荧 光 信号的微滴判读为 0。然后根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。 本文件通过特异性引物和探针进行数字 RT-PCR扩增，从而对乙型脑炎病毒核酸进行检测。 6 试剂与材料 6.1 引物和探针 上游引物 （JEV F）： 5＇- ACCAAGAAGTCTACGTCCAATATGG -3＇ 下游引物 （JEV R）： 5＇- TTGGACCGACACGGATCTC -3＇ 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 40 -2020 3 探针（JEV P）： 5＇- FAM -TGCACGCGGACCAGGCATTC -BHQ 1 -3＇ 6.2 核酸提取试剂 选取针对提取病毒 RNA的提取试剂盒，或等效的其他 RNA提取试剂。 6.3 数字 RT-PCR反应试剂 按照不同的微滴式数字 PCR平台的说明书选取其推荐的数字 RT-PCR反应试剂盒，或等效的其他 反应试剂 。 7 仪器与设备 7.1 Ⅱ级生物安全柜 。 7.2 微滴式数字 PCR平台。 7.3 纯水仪。 7.4 高速冷冻离心机 。 7.5 组织研磨器 。 7.6 涡旋震荡仪。 8 操作步骤 8.1 样品采集及运输 采集濒死动物、扑杀动物或流产胎儿脑组织，或待 检活动物血液等，具体要求 按照 NY/T 541 执行。 8.2 样品处理 8.2.1 脑组织 取适量待检脑组织，按 1:10体积加入 PBS，置于组织研磨器中充分研磨。将研磨后的样品，反复冻 融3次， 10000 r/min 离心 5 min，取上清液至无菌离心管中。 8.2.2 血液 将采集的血液以 2500 r/min 离心 5 min，分离出血清至无菌离心管中。 8.3 RNA提取 按照所选取的病毒 RNA提取试剂盒 说明书进行提取 ，或其他等效的 RNA提取方法 。 8.4 微滴式数字 RT-PCR扩增方法 8.4.1 微滴式数字 RT-PCR体系配制 微滴式数字 RT-PCR扩增体系配制按表 1所示。该步骤按照不同 品牌微滴式数字 PCR平台的说明 书进行操作。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 40 -2020 4 表1 微滴式数字 RT-PCR扩增体系 试剂 终浓度 体积 酶混合液a / 8 μL JEV F+R（10 μmol/L ） 0.9 μmol/L 1.8 μL JEV P（10 μmol/L ） 0.25 μmol/L 0.5 μL RNA模板 / 2 μL 无核酸酶 水 / 7.7 μL 总体系 / 20 μL 注：使用微滴式数字 PCR平台进行实验 时，应依据不同微滴式数字 PCR平台调整 扩增体系的组分和最终体积， 表中所列组分的终浓度不变。 a 微滴式数字 RT-PCR扩增试剂。 8.4.2 微滴生成、数字 RT-PCR扩增及结果读取 反应液配制后，使用微滴 发生器对扩增体系进行微滴生成。微滴生成后，进行微滴式数字 RT-PCR 扩增。荧光分析步骤采用 FAM单荧光通道，微滴式数字 RT-PCR扩增程序按表 2所示。 表2 微滴式数字 RT-PCR扩增程序 步骤 温度 持续时间 循环数 1 50 ℃ 20 min 1 2 95 ℃ 10 min 1 3 95 ℃ 30 s 40 4 55 ℃ 1 min 5 98 ℃ 10 min 1 6 12 ℃ 60 min 1 注：升降温速 率设置为 2.5 ℃/s。 8.5 微滴式数字 RT-PCR反应的对照 在进行微滴式 数字 RT-PCR实验时，应设置 阳性对照、 阴性对照与空白对照。 用含有乙型脑炎病毒 的RNA作为阳性对照；用未感染乙型脑炎病毒动物的组织混样基因组 作为阴性对照； 用无核酸酶 水作 为空白对照。各对照 RT-PCR扩增体系中，除模板外，其余组分 和RT-PCR扩增程序 与8.4.1和8.4.2相同。 9 结果分析 9.1 实验成立条件 微滴式数字 RT-PCR扩增结果，有效微滴 数不得低于 理论微滴数的 60 %。阴性对照 和空白对照 均未 检出阳性微滴，阳性对照有明显阳性微滴， 且核酸拷贝数浓度≥ 10 拷贝 /μL，则实验成立。 9.2 阈值设定 微滴式数字 RT-PCR结果中，阳性微滴和阴性微滴明显分开，阈值设在阳性微滴和阴性微滴分开的 区域。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 40 -2020 5 9.3 结果判定 9.3.1 阴性 样品中未检出阳性微滴 ，则判定为阴性。 9.3.2 阳性 样品中检测出阳性微滴 ，且阳性核酸拷贝数浓度≥ 3拷贝 /μL，则判定为阳性。 9.3.3 有效原则 样品中检测出阳性微滴 ，阳性核酸拷贝数浓度＜ 3拷贝 /μL，则需复检 。若复检结果仍 检测出阳性 微滴，则判定为阳性，否则判定为 阴性。 10 生物安全要求 检测过程中涉及的生物安全要求按照 GB 19489 实验室生物安全通用要求的规定执行。 ____________________________ _____ 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台