ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 43-2020 犬副流感病毒 RT-PCR检测方法 Detection of canine p arainfluenza by RT -PCR 2020-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 43-2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由青岛农业大学提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位：青岛农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、中国兽医药品监察所、上海基灵 生物科技有限公司、莱阳市农业农村局。 本文件主要起草人：张传美、刘佳卉、单虎、王媛媛、印春生、朱旭、张洪亮、杨海燕、孙建华、 于静静。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 43-2020 1 犬副流感病毒 RT-PCR检测方法 1 范围 本文件规定了犬副流感病毒 RT-PCR检测方法的缩略语、材料、操作步骤和结果判定。 本文件适用于犬等犬科动物口腔和鼻腔分泌物样品中的犬副流感病毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 RT-PCR：逆转录 -聚合酶链反应（ reverse transcription -polymerase chain reaction ） CPIV：犬副流感病毒 （canine parainfluenza virus ） RNA：核糖核酸（ ribonucleic acid ） PBS：磷酸盐缓冲液（ phosphate -buffered saline buffer ） 5 试剂和材料 5.1 试剂 5.1.1 总则：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 的要求，所有试剂均用 无RNA酶的容器分装。 5.1.2 市售商品化病毒 RNA提取试剂盒。 5.1.3 市售商品化一步法 RT-PCR试剂盒，包括一步法 RT-PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶 -反转录酶 - RNA酶抑制剂混合物、灭菌去离子水。 5.1.4 PBS溶液（按附录 A.1配制）。 5.1.5 TAE电泳缓冲液 ：50× TAE贮存液（按附录 A.2配制），临用时配成 1× TAE缓冲液。 5.1.6 1%琼脂糖凝胶（按附录 A.3配制）。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 43-2020 2 5.1.7 Goldview 核酸染料。 5.1.8 DNA 分子量标准： DL2000 DNA marker。 5.1.9 上游引物 5’-AGTTTGGGCAATTTTTCGTCC -3’；下游引物 5’- TGCAGGAGATATCTCGGGTTG -3’，目的片段 667 bp。 5.2 材料 5.2.1 1.5 mL RNase free 离心管 5.2.2 0.2 mL PCR薄壁管 5.2.3 移液器吸头 ：10 μL、200 μ L、1000 μ L 5.2.4 医用棉签 6 仪器设备 6.1生物安全柜 或超净工作台 6.2冰箱： 2 ℃~8 ℃、-20 ℃ 6.3高压蒸汽灭菌器 6.4组织研磨仪 6.5涡旋振荡器 6.6微量移液器（ 0.1 μL~2.5 μL、0.5 μL~10 μL、10 μL~100 μL、100 μL~1000 μL） 6.7基因扩增仪 6.8高速离心机（ 8000 g以上） 6.9分析天平 6.10水平电泳仪 6.11凝胶成像系统 7 样品的采集和前处理 7.1 总则 样品的采集、保存与运输 按照 NY/T 541 执行。生物安全要求按照 GB 19489 的规定。 7.2 采样器具处理 医用棉签、离心管及 PBS溶液经191 ℃~123 ℃高压蒸汽灭菌 15 min。 7.3 样品前处理 使用无菌棉签采集犬的口腔或鼻腔分泌物，放入 1.5 mL离心管中，加入 PBS 1 mL 稀释，震荡混匀 后弃去棉签。将稀释后的样品置于带有冰袋的样品运输箱内，送至实验室，在运输过程中冰袋应没有完 全融化。 8 操作方法 8.1 病毒RNA的提取 8.1.1 在样本制备区进行。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 43-2020 3 8.1.2 采用市售的病毒 RNA提取试剂盒按照说明书操作，也可采用其他等效的 RNA提取方法。在 生物安全柜或超净工作台中提取样品 RNA，提取过程应设立阴性和阳性对照。获得 RNA溶液，可直 接用于检测或保存于 -20 ℃备用。 8.2 扩增试剂的准备与配制 8.2.1 反应混合物在配制区进行。 8.2.2 每个检测反应体系需要 23 µ L RT -PCR反应液。按附录 A.4配制反应液，转移反应管至样本制 备区。 8.3 加样 8.3.1 在样本制备区进行。 8.3.2 在上述 8.2.2的反应管中分别加入 8.1.1中制备的 RNA溶液 2 µ L，使每管总体积达到 25 µ L， 记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。 8.4 RT-PCR反应 8.4.1 在扩增区进行。 8.4.2 将8.3.2中加样后的反应管放入基因扩增仪中，反应参数设置如下： 50 ℃ 30 min ；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环； 72 ℃ 5 min。 8.5 扩增产物电泳检测 8.5.1 在电泳成像区进行。 8.5.2 取5 μL PCR 扩增产物和 1 μL 6×Loading buffer加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳 同时设标准 DNA Marker 、阴性对照、阳性对照。 8.5.3 设置电压 80 V，电泳 30 min。 8.5.4 电泳结束后由凝胶成像系统观察 并拍照记录。 9 结果判定 9.1 结果分析条件设定 阳性对照品出现 667 bp扩增条带，同时阴性对照品无扩增条带 （见附录 B）。 9.2 结果描述与判定 待检样品扩增产物电泳出现 667 bp目标条带，判为 RT-PCR扩增阳性，表明样品中存在犬 副流感 病毒核酸；待检样品无扩增条带或扩增条带与预期大小不符，判为 PCR扩增阴性，表明样品中无犬 副 流感病毒核酸。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 43-2020 4 附 录 A （规范性） 溶液的配制 A.1 0.01 mol/L PBS 溶液（ pH 7.2 ~pH 7.4） 准确称量下面氯化钠 (NaCl) 8.00 g 、氯化钾 (KCl) 、磷酸二氢钾 (KH 2PO 4) 0.24 g、磷酸氢二钠 (Na 2HPO 4·12H 2O) 3.65 g ，加入到 800 mL蒸馏水中溶解，调 pH至7.2~7.4，加水定容至 1 L。分装后 121 ℃灭菌 15 min ~20 min，或过滤除菌，保存于室温。 A.2 TAE电泳缓冲液 50×TAE贮存液：三羟甲基氨基甲烷（ Tris）242.0 g、冰乙酸 57.1 mL、0.5 mol/L 乙二胺四乙酸 （EDTA）（ pH8.0）100.0 mL ，加双蒸水至 1000 mL。使用时稀释至 1×工作浓度。 A.3 1%琼脂糖凝胶 称取 1 g琼脂糖置于锥形瓶中，加入 100 mL 1×TAE缓冲液。微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化， 加入适量染料 ，混匀，倒入制胶板中 ，即成 1 %琼脂糖凝胶。 A.4 RT-PCR反应液配方 组分 1个检测体系的加入量 2×一步法 RT-PCR缓冲液 12.5 μL Taq DNA聚合酶 -反转录酶 -RNA酶抑制剂 1.25 μL 上游引物（ 10 μM） 1.0 μL 下游引物（ 10 μM） 1.0 μL 待检样品 RNA模板 2.0 μL 灭菌超纯水 7.25 μL A 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 43-2020 5 附 录 B （资料性） 检测样品电泳图示 检测样品中犬副流感病毒电泳例图 图B 检测样品中犬副流感病毒电泳图 说明： M——DNA分子量标准 DL2000； 1——阳性对照； 2——阳性样品 1； 3——阳性样品 2； 4——阳性样品 3； “-”——阴性对照。 667bp 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 43-2020 6 参