ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 44-2020 犬冠状病毒 RT-PCR检测方法 Detection of canine c oronavirus by RT -PCR 2020-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 44-2020 I 前 言 本文件按 照GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担 识别专利的责任。 本文件由青岛农业大学提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位：青岛农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、中国兽医药品监察所、青岛海润 检测股份有限公司、上海基灵生物科技有限公司、 莱阳市农业农村局。 本文件主要起草 人：张传美、单虎、王媛媛、印春生、刘刚、朱旭、刘佳卉、张洪亮、杨海燕、孙 建华、于静静。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 44-2020 1 犬冠状病毒 RT-PCR检测方法 1 范围 本文件规定了犬冠状病毒 RT-PCR检测方法的操作步骤和结果判定。 本文件适用于犬、狐狸等犬科动物粪便、肛拭子或肠道组织中犬冠状病毒核酸的实验室检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的 内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条 款。 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对 应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 RT-PCR：逆转录 -聚合酶链反应（ reverse transcription -polymerase chain reaction ） CCV：犬冠状病毒（ canine coronavirus ） RNA：核糖核酸（ ribonucleic acid ） PBS：磷酸盐缓冲液（ phosphate -buffered saline buffer ） 5 试剂和材料 5.1 试剂 5.1.1 总则：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 的要求，所有试剂均用 无RNA酶的容器分装。 5.1.2 市售商品化病毒 RNA提取试剂盒。 5.1.3 市售商品化一步法 RT-PCR试剂盒，包括一步法 RT-PCR缓冲液、 Taq DNA聚合酶 -反转录酶 - RNA酶抑制剂混合物、灭菌去离子水。 5.1.4 PBS溶液，按附录 A.1配制。 5.1.5 TAE电泳缓冲液 ：50× TAE贮存液，按附录 A.2配制，临用时加蒸馏水配成 1× TAE缓冲液。 5.1.6 1%琼脂糖凝胶，按附录 A.3配制。 5.1.7 Goldview 核酸染料。 5.1.8 DNA 分子量标准： DL2000 DNA marker。 5.1.9 上游引物 CTCGTGGYCGGAAGAATAAT -3’；下游引物： 5’-GCAACCCAGAMRACTCCATC - 3’；目的片段 280 bp。M、R为兼并碱基； M：A、C；R：A、G。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 44-2020 2 5.2 材料 5.2.1 RNase free 离心管： 1.5 mL、10 mL 5.2.2 0.2 mL PCR薄壁管 5.2.3 移液器吸头： 10 μL、200 μ L、1000 μ L 5.2.4 医用棉签 6 仪器设备 6.1 生物安全柜或超净工作台 6.2 冰箱： 2 ℃~8 ℃、-20 ℃ 6.3 高压蒸汽灭菌器 6.4 组织研磨仪 6.5 涡旋振荡器 6.6 微量移液器（ 0.1 μL~2.5 μL、0.5 μL~10 μL、10 μL~100 μL、100 μL~1000 μL） 6.7 基因扩增仪 6.8 高速离心机（ 8000 g以上） 6.9 分析天平 6.10 水平电泳仪 6.11 凝胶成像系统 7 样品的采集和前处理 7.1 总则 样品的采集、保存与运输 按照 NY/T 541 执行。生物安全要求按照 GB 19489 的规定。 7.2 采样器具处理 医用棉签、离心管及 PBS溶液经119 ℃~123 ℃高压蒸汽灭菌 15 min。 7.3 样品前处理 7.3.1 粪便 采集新鲜粪便中间未暴露部分 0.5 g ~1 g，放入 10 mL离心管中，加入 5mL~10 mL PBS 稀释，震荡 混匀，将稀释后的样品置于带有冰袋的样品运输箱内，送至实验室， 8000 g离心 5 min，取上清液待检。 7.3.2 肛拭子 将无菌棉签用 PBS浸湿后，轻轻旋转插入肛门深处 3 cm~5 cm，稍作停顿并旋转棉签，放入 1.5 mL 离心管，加入 1 mL PBS 稀释，震荡混匀后弃去棉签，将稀释后的样品置于带有冰袋的样品运输箱内， 送至实验室， 8000 g离心 5 min，取上清液待检。 7.3.3 肠道组织 取0.5 g ~1 g肠道组织，加入 5 mL ~10 mL PBS ，使用组织研磨仪研磨匀浆，或刮取病变肠道肠粘膜 0.5 g ~1 g加入 10 mL PBS 混匀，制成组织悬液，将稀释后的样品置于带有冰袋的样品运输箱内，送至 实验室， 8000 g离心 5 min，取上清液待检。 8 操作方法 8.1 病毒RNA的提取 8.1.1 在样本制备区进行。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 44-2020 3 8.1.2 采用市售的病毒 RNA提取试剂盒按照说明书操作，也可采用其他等效的 RNA提取方法。在 生物安全柜或超净工作台中提取样品 RNA，提取过程应设立阴性和阳性对照。获得 RNA溶液，可直 接用于检测或保存于 -20 ℃备用。 8.2 扩增试剂的准备与配制 8.2.1 反应混合物在配制区进行。 8.2.2 每个检测反应体系需要 23 µ L RT -PCR反应液。按附录 A.4配制反应液，转移反应管至样本制 备区。 8.3 加样 8.3.1 在样本制备区进行。 8.3.2 在上述 8.2.2的反应管中分别加入 8.1.1中制备的 RNA溶液 2 µ L，使每管总体积达到 25 µ L， 记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。 8.4 RT-PCR反应 8.4.1 在扩增区进行。 8.4.2 将8.3.2中加样后的反应管放入基因扩增仪中，反应参数设置如下： 50 ℃ 30 min ；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环； 72 ℃ 5 min。 8.5 扩增产物电泳检测 8.5.1 在电泳成像区进行。 8.5.2 取5 μL PCR 扩增产物和 1 μL 6×Loading buffer加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳 同时设标准 DNA Marker 、阴性对照、阳性对照。 8.5.3 设置电压 80 V，电泳 30 min。 8.5.4 电泳结束后由凝胶成像系统观察并拍照记录。 9 结果判定 9.1 结果分析条件设定 阳性对照品出现 280 bp扩增条带，同时阴性对照品无扩增条带 （见附录 B）。 9.2 结果描述与判定 待检样品扩增产物电泳出现 280 bp目标条带，判为 RT-PCR扩增阳性，表明样品中存在犬冠状病 毒核酸；待检样品无扩增条带或扩增条带与预期大小不符，判为 PCR扩增阴性，表明样品中无犬冠状 病毒核酸。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 44-2020 4 A A 附 录 A （规范性） 溶液的配制 A.1 0.01 mol/L PBS 溶液（ pH 7.2 ~pH 7.4） 准确称量下面氯化钠 (NaCl) 8.00 g 、氯化钾 (KCl) 、磷酸二氢钾 (KH 2PO 4) 0.24 g、磷酸氢二钠 (Na 2HPO 4·12H 2O) 3.65 g ，加入到 800 mL蒸馏水中溶解，调 pH至7.2~7.4，加水定容至 1 L。分装后 121 ℃灭菌 15 min ~20 min，或过滤除菌，保存于室温。 A.2 TAE电泳缓冲液 50× TAE贮存液：三羟甲基氨基甲烷（ Tris）242.0 g、冰乙酸 57.1 mL、0.5 mol/L 乙二胺四乙酸 （EDTA）（ pH8.0）100.0 mL ，加双蒸水至 1000 mL。使用时稀释至 1×工作浓度。 A.3 1%琼脂糖凝胶 称取 1 g琼脂糖置于锥形瓶中，加入 100 mL 1× TAE 缓冲液。微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化， 加 入适量染料，混匀，倒入制胶板中，即成 1 %琼脂糖凝胶。 A.4 RT-PCR反应液配方 组分 1个检测体系的加入量 2×