ICS 01.040.65 CCS B 04 TB 团 体 标 准 T/ NAIA 034—2021 枸杞中酚酸化合物含量的测定 高效 液相色谱法 Determination of phenolic acid compounds Content in Lycium barbarum L. by High-performance liquid chromatography 2021-03- 16发布 2021-04- 01实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规 则》的规定编写。 本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本文件起草单位：宁夏农产品质量标准与检测技术研究所、宁夏化学分析测试协会。 本文件主要起草人： 杨春霞、张 艳、闫 玥、周丽娜、 开建荣、 牛 艳、王彩艳、 王晓 菁、李 冬、单巧玲、王晓静、 张小飞。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 枸杞中酚酸化合物含量的测定 高效液相色谱法 1　范围 本文件规定了枸杞中 9种酚酸化合物含量的高效液相色谱测定方法。 本文件适用于枸杞中没食子酸、咖啡酸、阿魏酸、原儿茶醛、儿茶素、绿原酸、丁香 酸、香豆酸、表儿茶素含量的测定。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版 本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 2012 水果及其制品中游离酚酸含量的测定 NY/T 3290 分水果、蔬菜及其制品中酚酸含量的测定 液质联用法 3　术语和定义 4　原理 枸杞中的酚酸类化合物用 30%-40% 乙醇回流提取，样液经酸化后用乙酸乙酯萃取，有 机层浓缩复溶定容，微孔滤膜过滤，高效液相色谱法测定，外标法定量。 5　试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为色谱纯的试剂和 GB/T 6682规定的一级水。 5.1　无水乙醇（ CH 3CH 2OH）：优级纯。 5.2　乙腈（ CH 3CN）：色谱纯。 5.3　盐酸（ HCl）：优级纯。 5.4　甲醇（ CH 3OH）：色谱纯。 5.5　氢氧化钠（ NaOH）：优级纯。 5.6　磷酸溶液（ H3PO 4）：优级纯。 5.7　乙酸乙酯（ CH 3COOCH 2CH 3）：分析纯。 5.8　提取剂：取 30 mL或40 mL无水乙醇，加入 70 mL或60 mL水混匀，即为 30 %~40 %乙醇提取剂。 5.9　10 %盐酸溶液：取 381 mL超纯水，加入 37 %盐酸 119 mL，混匀。 5.10　没食子酸标准品（ CAS 149-91-7，HPLC ≥ 98 %）。 5.11　香豆酸标准品（ CAS 500-05-0，HPLC ≥ 98 %）。 5.12　原儿茶醛标准品（ CAS 139-85-5，HPLC ≥98 %）。 5.13　儿茶素标准品（ CAS 154-23-4，HPLC ≥ 98 %）。 全国团体标准信息平台 5.14　绿原酸标准品（ CAS 327-97-9，HPLC ≥ 98 %）。 5.15　咖啡酸标准品（ CAS 331-39-5，HPLC ≥ 98 %）。 5.16　表儿茶素标准品（ CAS 490-46-0，HPLC ≥98 %）。 5.17　丁香酸标准品（ CAS 530-57-4，HPLC ≥98 %）。 5.18　阿魏酸标准品（ HPLC98≥% ）。 5.19　酚酸标准 储备液：分别精密称取 5.0 mg（精确到 0.1 mg）没食子酸、香豆酸、原 儿茶醛、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、丁香酸、阿魏酸标准品，用甲醇溶解到 10 mL棕色容量瓶中， 配制成浓度为 0.5 mg/mL，于 -20 ℃冰箱中贮存。 6　仪器和设备 6.1　高效液相色谱仪：配紫外检测器。 6.2　组织捣碎机。 6.3　分析天平：感 量0.01 g和0.0001 g。 6.4　振荡器：带有温度控制。 6.5　水浴锅： 0-100 ℃。 6.6　球型冷凝回流管。 6.7　超纯水机。 6.8　旋转蒸发仪：带有温度控制。 6.9　0.45 µm有机相微孔滤膜。 7　试样的制备 枸杞样品于 -18 ℃冷冻冰箱中保存。试验时将样品取出，采用四分法，混合均匀后缩 分至 100 g，立即用高速万能粉碎机粉碎，置于样品瓶中， -18 ℃冷冻备用。 8　试样的提取 取枸杞粉末以体积浓度为 30%-40 %的乙醇溶液按体积分数为样品总重量的 10倍量进行 提取，室温下振荡提取 2 h，振荡液于水浴中回流 1.5 h-2 h，回流后的样液趁热过滤到浓缩 瓶中过滤，残留物用乙醇洗涤 2-3次，乙醇用量控制在 2-3 mL，合并收集提取液，用提取剂 定容至 50 mL棕色容量瓶中。提取液一并于 100 mL旋转蒸发瓶中，在 40 ℃减压浓缩，蒸馏 后用浓度为 10 %的盐酸调节 pH值为 2.5-3.0。酸化液中加入 20 mL乙酸乙酯萃取，分离有机 溶剂层，然后经减压浓缩去除残留的乙酸乙酯，用 2 mL无水乙醇复溶后过 0.45 μm微孔滤 膜，样液供上机测定。 9　仪器参考条件 9.1　色谱柱： LP-C18型商品柱（ 25 cm×4 cm I.D.），或相当者。 9.2　流速： 1.0 mL/min。 9.3　柱温： 30.0 ℃。 9.4　检测波长： 280 nm。 9.5　进样量： 10 μL。 9.6　流动相：见表 1。 全国团体标准信息平台 表1 流动相梯度洗脱程序 时间 / min 流速 mL/min A相（ 0.1%磷酸水溶液） % B相（乙腈） % 0 1.0 95 5 5 1.0 95 5 65 1.0 70 30 66 1.0 95 5 75 1.0 95 5 10　标准曲线的绘制 用甲醇将酚酸标准储备液（ 4.11）按不同倍数稀释，制备系列混合酚酸标准工作液， 各酚酸浓度依次为 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/L，以质量浓度 x（mg/L）为横 坐标，以相应的响应峰面积 y为纵坐标绘制标准曲线（酚酸溶液标准色谱图见附录 A）。 11　测定 将待测液上机测定，根据标准曲线得到待测液中各酚酸的浓度，以保留时间定性，色 谱峰面积定量，试样溶液中酚酸响应值均应在标准曲线范围内。 12　空白试验 除不加试样外，均按上述步骤进行操作。 13　结果计算 枸杞样品中酚酸的含量按公式（ 1）计算： ...................................... （1） 式中： X—枸杞样品中酚酸含量，单位为毫克每千克， mg/kg； C—样液中酚酸测定质量浓度，单位为毫克 /升， mg/L； V—样品最终定容体积，单位为毫升， mL; m—称取样品的质量，单位为克， g； n—稀释倍数。 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三 位有效数字。 14　精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的 20%。 nmVCX 10001000 全国团体标准信息平台 15　定量限 当枸杞样品为 2.0 g 时，没食子酸、咖啡酸、原儿茶醛、绿原酸、丁香酸、香豆酸、表 儿茶素定量限为 1.0 mg/kg，儿茶素定量限为 2.0 mg/kg，阿魏酸定量限为 2.5 mg/kg。 全国团体标准信息平台 附　录　 A （资料性） 酚酸标准溶液色谱图 1、没食子酸； 2、香豆酸； 3、原儿茶醛； 4、儿茶素； 5、绿原酸； 6、咖啡酸； 7、丁香 酸； 8、表儿茶素； 9、阿魏酸； 全国团体标准信息平台