ICS 67.160.10 X 62 团 体 标 准 T / N A I A 0 2 6 —2 0 2 1T/ NAIA 051-2021 枸杞清汁(浆)中甜菜碱含量的测定 高效液相色谱法 Determination of betaine in lycium barbarum juice (pulp)-HPLC method 2021-05-30发布 2021-06-01实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 发布TB 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规 则》的规则起草。 本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本文件起草单位 ：宁夏菲杰特检测有限公司、宁夏早康枸杞股份有限公司、宁夏化学分 析测试协会。 本文件主要起草人：王欢、张海星、吴秀玲、李亚辉、林桦、张小飞。 全国团体标准信息平台 枸杞清汁（浆）中甜菜碱含量的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了枸杞清汁（浆）中甜菜碱含量的测定方法。 本文件适用于枸杞清汁（浆）中甜菜碱含量的测定。 本方法取样量为 1g时，检出限为 0.001g/100g 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期 的引用文件 ，仅该日期对应的版本适用本文件 。不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所 有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 《分析实验室用水规格和试验方法》 NY/T 2947-2016 《枸杞中甜菜碱含量的测定 高效液相色谱法》 3 原理 试样中甜菜碱组分经甲醇 -水溶液的混合溶液提取后，用混合型阳离子交换固相萃取柱 净化，再用乙腈 -水溶液定容，利用高效液相色谱法检测，保留时间定性，外标法定量。 4 试剂与材料 4.1 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为 符合 GB/T 6682中规定的一级水。 4.1.1 氨水 (NH 3·H2O)：含量为 25%~28% ，优级纯。 4.1.2 盐酸 (HCl)：含量为 36%~38% ，优级纯。 4.1.3 甲醇 (CH 3OH)：色谱纯。 4.1.4 乙腈 (CH 3CN)：色谱纯。 4.2 试剂配制 4.2.1 盐酸溶液 c(HCl)=0.1mol/L: 准确吸取 9mL浓盐酸， 加适量水并稀释定容至 1000mL。 4.2.2 甲醇 -水溶液 (25+75):取25mL甲醇慢慢加入 75mL水中。 4.2.3 甲醇 -水溶液 (85+15):取85mL甲醇慢慢加入 15mL水中。 4.2.4 氨化甲醇溶液 (5+95):取5mL浓氨水慢慢加入 95mL甲醇中。 4.2.5 乙腈 -水溶液 (75+25):取75mL乙腈慢慢加入 25mL水中。 全国团体标准信息平台 4.3 标准品 甜菜碱标准品（ C5H11NO 2，CAS号：107-43-7）：纯度≥98.0%，或经国家认证并授予 标准物质证书的标准物质。 4.4 标准溶液配制 4.4.1甜菜碱标准储备液溶液： 准确称取甜菜碱标准物质 100mg（精确到 0.0001g）用乙腈 - 水溶液 (4.2.5)溶解并定容至 10.0mL，配制成 10.0mg/mL标准储备液， 0℃~4℃贮存。 4.4.2甜菜碱标准系列工作溶液 ：准确吸取标准储备液 0µL、20µL、50µL、100µL、200µL、 500µL、1000µL、2000µL至10mL容量瓶中，用乙腈 -水溶液 (4.2.5)定容至刻度，配制成质 量浓度分别为 0g/100mL 、0.002g/100mL 、0.005g/100mL 、0.01g/100mL 、0.02g/100mL 、 0.05g/100mL 、0.1g/100mL 、0.2g/100mL 的标准系列工作溶液。 4.5 材料 4.5.1 一次性微孔滤头： 0.45µm，有机相。 4.5.2 塑料离心管： 50mL。 4.5.3 阳离子交换固相萃取小柱 ：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为聚苯乙烯一二乙烯 基苯高聚物， 150mg/6mL ，或相当者。 使用前依次用 5mL甲醇、 5mL 0.1mol/L盐酸溶液活 化平衡。 5 仪器与设备 5.1 液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。 5.2 分析天平： 感量 0.001g和0.0001g。 5.3 离心机：转速≥ 3500r/min 。 5.4 涡旋混合器。 5.5 涡旋振荡器。 5.6 旋转蒸发仪。 6 试样制备 取多个预包装的枸杞清汁（浆）样品直接混合， -18℃冷冻备用。 7 分析步骤 7.1 提取 称取枸杞清汁（浆） 1g（精确到 0.001g）于50mL离心管中加入 25.0mL甲醇 -水溶液 (4.2.2)，涡旋混匀 1min，置于涡旋振荡器中振荡 30min，3500r/min 离心 5min，取上清液备 用。 全国团体标准信息平台 7.2 净化 吸取上清液 5.00mL转入已活化平衡的混合型阳离子交换固相萃取柱中 ，控制流速 1滴 /s，待样液进入萃取小柱的吸附层后 ，依次用 5mL甲醇 -水溶液 (4.2.3)、5mL甲醇进行淋洗 ， 弃去淋洗液， 最后用 5mL氨化甲醇溶液 (4.2.4)，洗脱并收集，重复洗脱一次，将洗脱液旋 转浓缩至近干， 用2mL乙腈 -水溶液 (4.2.5)溶解，经0.45µm滤膜过滤后上机待测。 7.3 色谱参考条件 7.3.1 色谱柱：氨基色谱柱， 250mm×4.6mm ，5µm；或具有同等性能的色谱柱。 7.3.2 流动相：乙腈 +水=85+15（体积比）。 7.3.3 流速： 1.0mL/min 。 7.3.4 进样量： 10.0µL。 7.3.5 柱温： 30℃。 7.3.6 检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器。 7.3.7 检测波长： 205nm。 7.4 测定 7.4.1 标准曲线的制作 系列标准工作溶液由低到高浓度依次进样检测 ，以峰面积为纵坐标 -浓度为横坐标作图 ， 得到标准曲线回归方程。 7.4.2 试样溶液的测定 待测溶液中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内 ，浓度超过线性范围的样品则 应稀释后重新进行分析。 7.4.3 空白试验 不称取试样， 按7.1和7.2的步骤做空白试验。 8 结果计算 试样中甜菜碱含量按式 (1)计算。 式中： X 试样中甜菜碱的含量，单位为克每百克 (g/100g)。 ρ 从标准曲线得到的待测液中甜菜碱的质量浓度，单位为克每百毫升 (g/100mL) 。 V 试样中加入的提取液体积，单位为毫升 (mL)。 ）（ρ1…………………………………………… 21 VmVVX 全国团体标准信息平台 V1 试样的最终定容体积，单位为毫升 (mL)。 m 样品的称样质量，单位为克 (g)。 V2 提取液分取体积，单位为毫升 (mL)。 计算结果需扣除空白值，测定结果 保留 3位有效数字。 9 精密度 在重复条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值 的10 %。 10 色谱图 甜菜碱标准溶液色谱图见附录 A。 附 录 A (资料性附录 ) 图 甜菜碱标准溶液色谱图（ 0.02g/100mL ） 全国团体标准信息平台