ICS65.020.30 B43 团体标准 T/SDAA015－2021 畜禽用噬菌体制剂 BacteriophagePreparationforLivestock 2021－06－22发布 2021－07－23实施 山东省畜牧协会发布 全国团体标准信息平台 T/SDAA015-2021 全国团体标准信息平台 IIT/SDAA015-2021 前言 本标准按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧协会提出并归口。 本文件起草单位：青岛农业大学、山东益生种畜禽股份有限公司、山东鲁丰集团有限公司、青岛诺安百 特生物技术有限公司。 本文件主要起草人：张灿、尹燕博、郭龙宗、刘海燕、李忠晓、任慧英、潘强、王守春。 全国团体标准信息平台 3T/SDAA015-2021 全国团体标准信息平台 4T/SDAA015-2021 畜禽用噬菌体制剂 1范围 本文件规定了畜禽用噬菌体制剂的术语和定义、质量要求和理化指标、试验方法、 标签、包装、运输及贮存要求。 本文件适用于裂解大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的单株或 多株噬菌体为主要原料的畜禽用噬菌体制剂的质量控制。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期 的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本文件。 GB10648饲料标签 GB4789.2食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 GB/T191包装储运图示标志 GB/T9742化学试剂pH值测定通则 GB/T36911运输包装指南 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 噬菌体bacteriophage,phage 一类能感染细菌、真菌、藻类、放线菌、支原体及螺旋体等微生物的一类病毒的总称， 亦称细菌病毒。 3.2 噬菌斑plaque 噬菌体侵染细菌，导致宿主细胞溶解死亡，在琼脂培养基生长的菌苔上形成的空斑。 全国团体标准信息平台 5T/SDAA015-2021 3.3 畜禽用噬菌体制剂bacteriophagepreparation 含有一株或多株噬菌体为主要成分的制剂。 4质量要求及其理化指标 4.1噬菌体制剂安全要求 4.1.1噬菌体产品应符合国家生物安全法的要求。 4.1.2噬菌体制剂中的噬菌体毒株应安全、有效。 4.1.3噬菌体制剂中的噬菌体毒株应为裂解性噬菌体，遗传背景明确，不携带毒力基因、整 合基因。 4.1.4噬菌体制剂产品应有企业标准。 4.2噬菌体制剂理化指标 噬菌体制剂的理化指标见附录A.1，附录A.2。 5试验方法 5.1性状 将样品放置在洁净的烧杯内，在光线充足、非直射日光、无异味的环境中，用眼观的方 法观察其色泽，用鼻嗅的方法检查其气味。 5.2pH值 按照GB/T9742规定执行。 5.3效价 按照附录B中的B.4.1的规定执行。 5.4杂菌数 噬菌体制剂中仍存活的细菌视为杂菌。杂菌数按照GB4789.2规定的微生物菌落总数 测定方法执行。 全国团体标准信息平台 6T/SDAA015-2021 5.5裂解效率 按照附录B中B.4.2的规定执行。 6标签、包装、运输、贮存 6.1标签 噬菌体制剂的标签应符合GB10648的规定。标签完整、清晰，标签说明上应注明噬菌 体制剂的种类、含量、用法、贮藏条件和方法、保质期、企业名称、生产地址、联系方式等。 6.2包装 噬菌体制剂包装应符合GB/T191规定。液体制剂采用塑料瓶或玻璃瓶，规格为：100mL、 200mL、500mL/瓶等，或按用户指定要求。粉末制剂的小包装采用铝箔袋，规格为50g、 100g、200g、500g、1kg/袋等，或根据用户提出的净含量要求进行包装。粉末制剂的大包 装采用内衬塑料袋的编织袋或瓦楞纸箱，每袋（或箱）的规格为5kg、10kg、20kg、25kg 等，或根据用户提出的净含量要求进行包装。净含量应符合国家质量监督检验检疫总局《定 量包装商品计量监督管理办法》的规定。 6.3运输 噬菌体制剂运输应符合GB/T36911运输包装指南。 6.4贮存 噬菌体制剂应保存于干燥、避光处，2℃~8℃冷藏保存，在符合运输、贮存条件的情 况下，原包装（未开封）产品的保质期为3个月以上。 全国团体标准信息平台 7T/SDAA015-2021 附录A （规范性） 噬菌体制剂理化指标 A.1液体噬菌体制剂理化指标 表A.1液体噬菌体制剂理化指标 项目 指标 性状 制剂颜色为无色至淡黄色，色泽一致，可有少量 絮状沉淀；有培养基自然气味，无发霉、变质现象， 无酸败等气味。 效价，PFU/mL ≥1.0×108 裂解效率，% ≥90 pH值 6.0~8.5 杂菌数，CFU/mL ＜100 A.2固体噬菌体制剂理化指标 表A.2固体噬菌体制剂理化指标 项目 指标 性状 制剂颜色为白色至淡黄色的粉末或细小颗粒状， 色泽一致，无发霉、结块现象，有培养基自然气味， 无酸败等气味。 水分 ≤15% 效价，PFU/mg ≥1.0×108 裂解效率，% ≥90 pH值 6.0~8.5 杂菌数，CFU/mg ＜100 全国团体标准信息平台 8T/SDAA015-2021 附录B （规范性） 噬菌斑、噬菌体效价及噬菌体裂解效率测定方法 B.1仪器设备 B.1.1恒温培养箱：36℃±1℃ B.1.2离心机：转速12000转 B.1.3超净工作台 B.1.4高压蒸汽灭菌锅 B.1.5恒温震荡培养器：36℃±1℃~42℃±1℃ B.1.6电子分析天平：感量0.001g B.1.7电热恒温鼓风干燥箱：10℃~200℃ B.1.8冰箱：-40℃以下和-20℃～8℃ B.1.9无菌培养皿：Φ90mm B.1.10微量移液器：0.5μL~10μL、10μL~200μL、100μL~1000μL B.1.11漩涡混合仪 B.1.12细菌涂布器 B.2试剂和材料 B.2.1LB培养基 B.2.2LB固体培养基 B.2.3氢氧化钠 B.2.4盐酸 B.2.5宿主菌（增殖对应的噬菌体） B.3双层琼脂培养基制备 B.3.1上层固体培养基配置： 全国团体标准信息平台 9T/SDAA015-2021 LB固体培养基2.5%（g/100mL） 琼脂粉0.75%（g/100mL） pH值调节到7.2~7.4。 B.3.2下层固体培养基配置： LB固体培养基2.5%（g/100mL） 琼脂粉1.5%（g/100mL） pH值调节到7.2~7.4。 B.3.3液体培养基配置： LB培养基2.5%（g/100mL） 琼脂粉1.5%（g/100mL） pH值调节到7.2~7.4。 B.3.4灭菌 配制的培养基于121℃高压灭菌20min。 B.4检测步骤 B.4.1噬菌体效价测定 取噬菌体制剂样本1mL(1mg)，加入9mL生理盐水中，涡旋混匀，重复上述操作，按照 制剂标注的噬菌体含量，将噬菌体制剂样本依次稀释到1×102PFU/mL。每次检测设三个平 行，取100μL噬菌体稀释液样品，加入至100μL敏感宿主菌的增殖液中，混匀，于宿主菌最 佳培养温度条件下孵育5min，加入5mL上层半固体培养基，混匀后，倾倒在下层固体培养 基上，室温静置至上层半固体培养基凝固。于宿主菌最佳培养条件下倒置培养3h~8h，统 计噬菌斑个数，按照B.4.2.3要求，根据公式(B.1)计算噬菌体效价，三个平行结果取算术平 均值。该试验重复三次，报告结果取三次噬菌体效价的算术平均值，结果保留2位有效数字。 噬菌体效价（PFU/mL）=噬菌斑数×稀释倍数×10…………………………….(B.1) B.4.2噬菌体裂解效率测定 B.4.2.1宿主菌稀释 选择用于增殖噬菌体的宿主菌，取1mL新鲜制备的宿主菌增殖液，加入9mL生理盐水 中，涡旋混匀，重复上述操作，根据宿主菌增殖液的初始效价直至将宿主菌效价稀释到1×105 CFU/mL。 B.4.2.2裂解效率测定 取1mL(1mg)待测定的噬菌体制剂样本，加入1mL效价为1×105CFU/mL的宿主菌稀释 液中，室温静置孵育30min，轻轻混匀后用无菌生理盐水将混合液稀释到10-1、10-2、10-3三 全国团体标准信息平台