ICS65.120 B46 T SHAAV 团 体 标 准 T/SHAAV008—2021 猫五种人畜共患病病原检测微流控芯片法 Microfluidicchipmethodfordetectionoffivezoonoticpathogensincats 2021-09-06发布 2021-09-06实施 上海市畜牧兽医学会  发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/SHAAV008—2021 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由上海市畜牧兽医学会提出并归口。 本文件起草单位：上海市动物疫病预防控制中心、无锡科智达科技有限公司、宁波爱基因科技有限 公司。 本文件主要起草人：李鑫、鞠厚斌、赵洪进、王建、唐大运、杨德全、卢先东、陈俊飞、沈海潇、 葛菲菲、杨显超、陶田谷晟、刘健、于慧茹。 本文件首批承诺执行单位名单：上海市动物疫病预防控制中心、无锡科智达科技有限公司、宁波爱 基因科技有限公司。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/SHAAV008—2021 1猫五种人畜共患病病原检测微流控芯片法 1范围 本文件规定了猫五种人畜共患病病原的微流控芯片检测方法。 本文件适用于猫布鲁氏菌、弓形虫、钩端螺旋体、汉塞巴尔通体、猫流感病毒五种病原核酸的快速 检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification） RNA：核糖核酸（ribonucleicacid） 5原理 将待测样品提取核酸后，注入预先包埋五种人畜共患病病原特异性引物的微流控芯片中，进行反转 录和LAMP恒温扩增，通过微流控芯片核酸检测仪实时捕捉SYBRGreen荧光信号，根据荧光信号出 现的时间、强度和位置，判断样品中是否含有目标病原。 6试剂和材料 6.1试剂 6.1.1总体原则：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682的要求，所有试剂 均用无RNA酶的容器分装。 6.1.2异丙醇：-20℃预冷。 6.1.3氯仿：2℃~8℃保存。 6.1.4TRIzol：2℃~8℃保存。 6.1.5DNAzol：2℃~8℃保存。 6.1.60.05mol/LTris-HCI稀释液（pH8.0），2℃~8℃保存。 6.1.775%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。 全国团体标准信息平台 T/SHAAV008—2021 26.1.8试剂管：反转录酶、BstDNA聚合酶、dNTPs等混合冻干颗粒，2℃~8℃保存。 6.1.98mmol/LNaOH溶液：称量0.32gNaOH，溶解到1000mL去离子水中，混匀，室温保存。 6.1.10DEPC处理水：将DEPC加入去离子水（符合GB/T6682要求）中至终浓度为0.1%（体积比）， 充分混合均匀后作用12h，分装，121℃±2℃高压灭菌30min，冷却后2℃~8℃保存。 6.2材料 6.2.1芯片：5个检测区分别含有检测猫布鲁氏菌、弓形虫、钩端螺旋体、汉塞巴尔通体、猫流感病 原目的基因的LAMP扩增引物（见附录A）。 7仪器设备 7.1Ⅱ级生物安全柜。 7.2微流控芯片核酸检测仪。 7.3高速冷冻离心机。 7.4振荡器。 7.5微量移液器：10µL，100µL，1000µL。 7.6冰箱（2℃~8℃和-20℃以下）。 8样品的采集和处理 8.1总体要求 样品的采集、保存与运输按照NY/T541执行。生物安全要求按照GB19489的规定。 8.2样品处理 8.2.1全血样品：用无菌真空采血管（EDTA抗凝剂）采集四肢静脉血液1mL，快速上下颠倒混匀后 转入无菌离心管中，编号备用。 8.2.2肛拭子、鼻咽拭子样品：将肛拭子或鼻咽拭子样品在振荡器上充分混合后，将拭子中的液体挤 出后弃去拭子。3000r/min离心5min，取上清液，转入1.5mL灭菌离心管中，用于后续的核酸提取。 9操作步骤 9.1样品RNA提取 9.1.1在样本制备区进行，采取TRIzol裂解法提取；也可采用其他等效的RNA提取方法。 9.1.2待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5mL离心管，逐管编号。 9.1.3每管加入600µLTRIzol。 9.1.4每管对应编号分别加入200µL待检样品、阳性对照或阴性对照，混匀。 9.1.5每管加入200µL氯仿，充分颠倒混匀。于4℃、12000r/min离心15min。 9.1.6新取n个灭菌的1.5mL离心管，逐管编号，每管加入500µL异丙醇（-20℃预冷）。 9.1.7吸取本标准9.1.5各管中的上清液500µL，转移至9.1.6相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混 匀。 9.1.8于4℃、12000r/min离心15min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沥干液体，不同样品应 在吸水纸上分散放置，避免交叉污染。 9.1.9每管加入600µL75%乙醇（-20℃预冷），上下颠倒数次，洗涤核酸沉淀。 9.1.10于4℃、12000r/min离心10min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沥干液体，不同样品 应在吸水纸不同地方沥干。 9.1.114000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量移液器尽量将其吸干。注意一 份样本换用一个吸头，吸头不要触及核酸沉淀。 9.1.12室温干燥3min。不宜干燥时间过长，以免核酸难以溶解。 全国团体标准信息平台 T/SHAAV008—2021 39.1.13每管加入11µLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的核酸，2000r/min离心5s，获得纯化的核 酸溶液，直接用于检测或保存于-20℃备用。 9.2样品DNA提取 9.2.1在样本制备区进行。DNA提取使用DNAzol裂解法提取；也可采用其他等效的DNA提取方法。 9.2.2待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5mL离心管，逐管编号。 9.2.3每管加入800µLDNAzol。 9.2.4每管对应编号分别加入200µL待检样品、阳性对照和阴性对照，混匀，于4℃、10000r/min 离心10min。 9.2.5取900µL上清液，置新的灭菌1.5mL离心管中，加入500µL无水乙醇，混匀，室温放置3min， 于4℃、10000r/min离心5min。 9.2.6弃上清液，沿管壁缓缓加入900µL无水乙醇，颠倒洗涤，于4℃、10000r/min离心5min。反 复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器移去残液。 9.2.7用50µL8mmol/LNaOH溶液溶解沉淀，2000r/min离心5s，获得纯化的DNA溶液，直接用 于检测或保存于-20℃备用。 9.3扩增试剂的准备与配制 9.3.1在试剂储存和准备区进行。 9.3.2打开真空包装袋，将芯片和试剂管取出。 9.3.3取40µLTris-HCl稀释液至试剂管中，再加入RNA和DNA核酸提取液各5µL，反复吹打混匀 且干粉全部溶解。转移试剂管至样本制备区。 9.4加样 9.4.1在样本制备区进行。 9.4.2吸取上述9.3.3的试剂管中的混合液50µL垂直加入芯片中封口膜下方的加样孔。 9.4.3移除封口膜背签，将加样孔和逃气孔用封口膜密封后须在3min内完成检测。 9.5检测 9.5.1在扩增区进行。 9.5.2将9.4.3中加样后的芯片放在微流控核酸检测仪中进行LAMP反应，参数见表1。检测完成后， 仪器自动进行数据分析。 表1LAMP反应参数 步骤 温度（℃） 时间（min） 1 42 10 2 65 40 10试验对照 检测过程中分别设空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照以DEPC水代替核酸模板；阴性对照 为非目标病原的核酸提取物；阳性对照为含有目标病原目的基因的阳性质粒。 11结果判定 11.1试验成立的条件 11.1.1空白对照检测结果为“阴性”。 11.1.2阴性对照检测结果为“阴性”。 11.1.3阳性对照检测结果为“阳性”。 11.1.4如空白对照、阴性对照和阳性对照同时满足以上条件，此次检测结果将视为有效。 全国团体标准信息平台 T/SHAAV008—2021 411.2结果描述及判定 11.2.1阴性 当检测指标值大于该指标阳性判断值且未出现典型扩增曲线时，判定为阴性，表示样品中无该病原 体核酸。 11.2.2阳性 当检测指标值小于或等于该指标阳性判断值且出现典型扩增曲线时，判定为阳性，表示样品中有该 病原体核酸。 11.2.3各指标阳性判断值见表2。 表2各指标的阳性判断值 指标名称 阳性判断值 布鲁氏菌 40 弓形虫 40 钩端螺旋体 39 汉塞巴尔通体 42 猫流感病毒 38 全国