ICS 65.020.30 B 43 团 体 标 准 T/CAAA 071—2021 梅花鹿冷冻精液生产技术规程 Frozen semen production technical code for sika deer 2021-07-19发布 2021-08-20实施 中国畜牧业协会 发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/CAAA 071 —2021 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国畜牧业协会提出并归口。 本文件起草单位： 黑龙江八一农垦大学、 哈尔滨博蒙生物科技有限公司、 黑龙江普惠特产有限公司、 黑龙江省农垦科学院哈尔滨特产研究所、中国农业科学院特产研究所、北京市畜牧总站、吉林大北农农 牧科技有限责任公司、黑河市吉骏鹿业有限公司。 本文件主要起草人： 韩欢胜、郑家三、赵列平、邢秀梅、张爱忠、史文清、王金涛、郭喜明、赵晓 静、王雪、王敏、杨淑华、库尔班·吐拉克、李文杰、鞠妍、曲凤玲、张金友、刘光前、潘春方、柴孟 龙、徐馨。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/CAAA 071 —2021 1 梅花鹿冷冻精液生产技术规程 1 范围 本文件规定了梅花鹿冷冻精液生产中种公鹿要求、人员要求、采精前准备、精液采集、精液冷冻、 冻精检测、冻精储藏与档案管理。 本文件适用于梅花鹿的人工繁育。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6935 中国梅花鹿种鹿 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 冷冻精液 frozen semen 简称冻精，是以液氮为冷源，将精液经过特殊处理后保存在超低温条件下（ -196 ℃）以达到长期保 存的精液。 4 种公鹿要求 符合本品种形态特征。 能正常繁殖后代，系谱清楚。 茸型正，茸色好，上冲。 鲜茸重应符合 GB/T 6935 一级以上的茸重要求。 4岁～8岁为宜。 应定期进行人畜共患病检测，健康无传染病。 膘情好、体格强壮、体况良好。 采精种鹿应单独饲养。 5 人员要求 由鹿保定人员、操作助手、采精人员、精液检测及冻存人员组成。 应具有一定的专业理论基础和现场工作经验，应无人畜共患传染病。 操作中应严格消毒，戴一次性手套，穿工作服。 应事先分工，操作过程中应密切配合。 6 采精前准备 采精室 6.1.1 面积15 m2～25 m2为宜，应安全、通风、保温和卫生，应设照明、电源插座和操作台。 6.1.2 墙壁、地面应采用瓷砖或便于消毒、防水的材质。 6.1.3 应采用无刺激性气味的消毒液 消毒。 全国团体标准信息平台 T/CAAA 071 —2021 2 用品 6.2.1 采精前应备齐所用药品与器械，具体参见附录 A。 6.2.2 接触精液的器皿应清洁无菌，应根据材质和现场条件选择适合的消毒方法。 常用的消毒方法有 以下几种： a) 煮沸消毒。适于玻璃、金属、塑胶器械及溶液消毒， 100 ℃下15 min，稀释液、冲洗液可水浴 消毒，煮沸 20 min即可。在消毒过程中，消毒的器械应浸入煮沸水中，塑料、橡胶器材应在沸 腾后立即取出 ； b) 火焰消毒。适于金属、玻璃器材 。应用酒精灯灼烧消毒，待降温后用 0.9 %的生理盐水冲洗后 备用； c) 酒精消毒 。适于玻璃、橡胶、金属器材，应用 75 %酒精擦拭，待酒精挥发后用生理盐水冲洗干 净，器材在使用前再次用生理盐水冲洗 ； d) 专用设备消毒 。高压灭菌锅、高温干燥箱、消毒柜。 6.2.3 消毒后的器械应用铝箔纸或封口纸封好。 6.2.4 精液冷冻细管应提前编号打号，应清晰 标注鹿品种、 公鹿号、生产时间和生产单位，具体参见 附录B。 6.2.5 应选用专用稀释液，现配现用，采精前应将其预热到 33 ℃～37 ℃。 6.2.6 每只采精种鹿准备 8个～10个集精杯， 应根据采精场地气温， 预先在集精杯夹层中注满 38 ℃～ 40 ℃水，封好，放入保温箱内。 6.2.7 应预先检查调试采精器。 采精场地 应进行清扫消毒。做到通风、干燥、清洁。 7 精液采集 保定 7.1.1 选择机械保定或麻醉保定。 7.1.2 应预先准备强心解救类药品。 采精 7.2.1 应采用电刺激采精。 7.2.2 首先将采精种公鹿直肠内宿粪掏出，然后剪去阴茎基部周围的毛，将腹部擦拭干净，用温热生 理盐水冲洗阴筒、包皮及阴茎，并擦干。 7.2.3 接精员应一手导出阴茎，一手持集精杯略向上倾斜包住阴茎龟头。 7.2.4 采精员将采精器探棒伸入直肠 20 cm～25 cm， 探棒金属环紧贴直肠腹面。 打开采精器电源开关， 电压由低向高逐档调节， 每次通电 5 s～9 s， 断电3 s～5 s， 每档通断交替刺激 5次～10次， 再升一档， 随电压逐渐升高阴茎勃起，直至射精。 7.2.5 射精开始后，每通断电 1次接精员应更换一个集精杯，直至射精结束。 7.2.6 将盛有精液的集精杯盖好，及时放入保温箱中，统一在操作室中进行精液品质检查。 7.2.7 采精结束后缓慢拔出探棒，采精器旋钮逐档归零，解除鹿的保定后应至少观察 30 min。 精液品质评定 7.3.1 集精杯内的精液应无尿液、血液和脏物。 7.3.2 质量应符合以下要求： a) 应为乳白或稍带黄色； b) 精液量应≥ 0.5 mL； c) 精子活力应≥ 0.7； 全国团体标准信息平台 T/CAAA 071 —2021 3 d) 精子畸形率应≤ 15 %； e) 精子密度应≥ 8亿/mL。 8 精液冷冻 精液稀释 8.1.1 应根据精子活力、密度确定稀释倍数，稀释后每毫升精液中应至少含有 1.0亿个有效精子。 8.1.2 应逐级等温稀释，稀释过程中不应将稀释液快速倒入精液中，应避免剧烈震荡。 装管 8.2.1 手工灌装或机器灌装。 8.2.2 细管、稀释液和精液的环境温度应保持在 4 ℃至38 ℃范围内的同一温度。 平衡 装管后的细管平行摆放在干的多层纱布或毛巾上，放入 4 ℃～6 ℃冰箱内，平衡 2 h～4 h。 冷冻 8.4.1 程序冷冻 8.4.1.1 在电脑中设置好冷冻的程序，冷冻仪与低温柜应尽量靠近，开启液氮罐阀门把冷冻仪降温到 4 ℃，关闭风扇电源。 8.4.1.2 风扇完全停止后应把排满细管的架子放入冷冻仪，开启冷冻程序进行冷冻。 8.4.1.3 降温程序。 1.5 h内由37℃降到-4℃。40 min内由-4 ℃降到-10 ℃。70 s内由-10 ℃降到-100 ℃。 30 s内由-100 ℃降到-140 ℃，最后放入液氮中。 8.4.2 冷冻液氮罐冷冻 8.4.2.1 将液氮倒入冷冻罐中，液氮量以冷冻罐 容积的1/2～2/3为宜。 8.4.2.2 应将网筛在液氮面上预冷，待液氮平稳时固定网筛，网筛与液氮面应平行，距离液氮面 2.5 cm～3.0 cm，冷冻温度宜在 -120 ℃至-140 ℃。 8.4.2.3 将平衡后的细管迅速平铺在网筛上，冷冻 8 min～10 min后将网筛连同细管一起浸入到液氮 中。 活力检查 8.5.1 抽样。每批精液冷冻后应随机抽取 1支～2支进行精子活力检查。 8.5.2 解冻方法。将细管从液氮中取出，快速浸入 38 ℃±2 ℃恒温水浴锅 10 s～15 s，取出擦干外管 壁残留水。 8.5.3 显微镜倍数以 400倍～640倍为宜，载玻片温度以 37 ℃±1 ℃为宜。 8.5.4 解冻后，精子活力≥ 0.3的冻精可进行包装贮存，活力 ＜0.3的应放弃。 冻精包装 8.6.1 应使用拇指管分装，细管棉塞端应朝下，分装时应将拇指管浸入液氮中。 8.6.2 分装后应将拇指管装入纱布袋，然后将纱布袋移入提筒放入液氮罐中，亦可将纱布袋直接放入 液氮罐中。 9 冻精检测 储藏前应对每批次冻精进行抽检。 冻精抽检结果 应符合下列条件： a) 精子活力应≥ 0.3； 全国团体标准信息平台 T/CAAA 071 —2021 4 b) 0.25 mL细管冻精解冻后，剂量不少于 0.19 mL； c) 有效精子数≥ 800万个/管； d) 精子畸形率≤ 20 %； e) 细菌菌落数应≤ 1000个/管。 10 冻精储藏 储藏室内应通风、干燥和避光，不应有异味。 液氮罐应远离水源、热源、火源。 不应与牛羊等其它动物的冻精同储。 液氮罐内液氮总量不足 1/3时，应及时补充。 应防止异物进入液氮罐内。 应减少开启液氮罐的次数和缩短每次开启时间。 取放冻精时，应先将镊子伸入液