ICS  67.120 X 18 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2817—2017 禽类产品中杆菌肽残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Method for the determination of bacitracin residues in poultry product-LC-MS/MS method 文稿版次选择 2017 - 03 - 30 发布 安徽省质量技术监督局 2017 - 04 - 30 实施 发 布 DB34/T 2817—2017 前    言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省检验检疫科学技术研究院、合肥市动物卫生监督所。 本标准主要起草人：宋伟、韩芳、吕亚宁、胡艳云、杨磊、周典兵、丁磊、盛旋、郑平。 I DB34/T 2817—2017 禽类产品中杆菌肽残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了禽类产品中杆菌肽残留量的液相色谱-串联质谱检测方法。 本标准适用于鸡肉、鸭肉、鸡肝、鸭肝等禽类产品中杆菌肽残留量的测定和确证。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法原理 样品中杆菌肽残留用 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液（pH=4.0±0.05）提取，经离心过滤后， 上清液用 HLB 固相萃取柱净化，液相色谱串联质谱仪测定，外标法定量。 4 试剂和材料 4.1 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 甲醇：色谱纯。 4.4 乙酸乙酯：色谱纯。 4.5 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）。 4.6 柠檬酸（C5H8O7 · 2H2O）。 4.7 磷酸氢二钠（Na2HPO4 · 12H2O）。 4.8 柠檬酸溶液：0.1 mol/L。称取 21.01 g 柠檬酸（4.5），用水溶解，定容至 1000 mL。 4.9 磷酸氢二钠溶液：0.2 mol/L。称取 28.41 g 磷酸氢二钠（4.6），用水溶解，定容至 1000 mL。 4.10 Mcllvaine 缓冲溶液：将 1000 mL 0.1 mol/L 柠檬酸溶液（4.7）与 625 mL 0.2 mol/L 磷酸氢二 钠溶液（4.8）混合，必要时用氢氧化钠或盐酸调节 pH=4.0±0.05。 4.11 Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液：0.1 mol/L。称取 60.5 g 乙二胺四乙酸二钠（4.4）放入 1625 mL Mcllvaine 缓冲溶液（4.9）中，使其溶解，摇匀。 4.12 0.1％甲酸甲醇溶液：称取 1 mL 甲酸于装有 800 mL 甲醇的 1 L 容量瓶中，用甲醇定容至 1000 mL。 4.13 Oasis HLB 固相萃取柱：500 mg，6 mL，或相当者。使用前分别用 5 mL 甲醇和 10 mL 水预处理， 保持柱体湿润。 4.14 杆菌肽标准物质：杆菌肽 A（CAS：1505-87-4），纯度均大于等于 92％，以下杆菌肽标准均以杆 菌肽 A 计。 1 DB34/T 2817—2017 4.15 杆菌肽标准储备溶液：准确称取适量的杆菌肽 A（4.13）于 50 mL 容量瓶中，用 0.1％甲酸甲醇 溶液配制成 0.1 mg/mL 标准储备溶液。储备在 2℃～4℃保存，可用 3 个月。 4.16 杆菌肽标准工作液：根据需要吸取适量杆菌肽标准储备溶液（4.14），配制成适用浓度的标准工 作液。该溶液在 0～4℃冰箱中保存。 4.17 0.22 μm 滤膜，有机系。 4.18 滤纸：快速。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 液相色谱串联四级杆质谱仪或相当者，配电喷雾离子源。 分析天平：感量为 0.01 g。 组织捣碎机。 均质器：10000 r/min。 高速冷冻离心机：转速不低于 8000 r/min。 pH 计：测量精度 ±0.02。 固相萃取装置：带真空泵。 氮吹浓缩仪。 涡旋混合器。 试样制备与保存 制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化。 从所取全部样品中取出约 500 g，用组织捣碎机充分绞碎均匀，装入洁净容器中，密封，并标明标 记，于 -18℃冰箱冷冻存放。 7 测定步骤 7.1 提取 称 取 均 质 样 品 5 g （ 精 确 至 0.01 g ） ， 置 于 50 mL 具 塞 塑 料 离 心 管 内 ， 加 入 20 mL Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液，以 10000 r/min 高速均质 1 min 后， 4℃下以 8000 r/min 的速度离心 10 min ， 将 上 清 液 经 滤 纸 过 滤 倾 入 另 一 100 mL 具 塞 塑 料 离 心 管 内 待 净 化 ， 再 用 20 mL Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液重复提取一次，滤纸过滤，合并上清液。 7.2 净化 在预处理过的固相萃取柱顶部连接贮液器，移入上述试管中的全部样液，待样液全部通过固相萃取 柱后，加入 2 mL 水，弃去全部流出液。然后将固相萃取柱于负压下抽干 30 min，最后用 3 mL 甲醇 洗脱，收集全部洗脱液于 10 mL 玻璃试管内，于 35℃水浴氮吹浓缩至近干，用初始流动相溶解残渣并 定容至 1.0 mL，清液过 0.22 μm 滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.3 测定 7.3.1 7.3.1.1 2 液相色谱参考条件 色谱柱：C18 柱，2.1×50 mm（内径），1.8 μm，或相当者； DB34/T 2817—2017 7.3.1.2 7.3.1.3 7.3.1.4 流动相：乙腈 +0.1％甲酸，梯度洗脱（梯度洗脱时间表见表 1）； 柱温：35℃； 进样量：5 μL。 表1 7.3.2 液相色谱梯度洗脱条件 时间 流速 乙腈 0.1％甲酸 (min) （mL/min） （％） （％） 0.00 0.3 15 85 1.00 0.3 15 85 1.50 0.3 25 75 2.50 0.3 25 75 3.00 0.3 90 10 3.50 0.3 90 10 4.50 0.3 15 85 10.00 0.3 15 85 质谱条件 7.3.2.1 离子源：电喷雾离子源（ESI）； 7.3.2.2 扫描方式：正离子扫描； 7.3.2.3 检测方式：多反应监测（MRM）； a) 使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；详细条件参见附录 B； b) 毛细管电压、雾化气压力、气帘气压力、辅助气流速、碎裂电压（FP）、碰撞气能量（CE）等 参数应优化至最优灵敏度，参考条件和定性离子对、定量离子见附录 B。 7.3.3 定量测定 取空白样品按照 7.1-7.2 处理，配制适用浓度的基质匹配标准工作液，按浓度由低到高进样检测， 以定量子离子峰面积-浓度作图，得到基质匹配标准曲线。在上述色谱条件下，杆菌肽参考保留时间为 3.13 min。其色谱行为见附录A。 待测样液中杆菌肽的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释至相应范围内再进样 分析。 7.3.4 定性确证 在相同实验条件下，试样中待测物质的保留时间与标准工作溶液中对应的保留时间偏差在 ±2.5％ 之内；且在扣除背景后的试样谱图中，所选择的离子对均出现，同时杆菌肽定性离子的相对丰度与标准 工作溶液中定性离子的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表2 规定的范围时，则可确定为样品中存在 杆菌肽残留。 表2 8 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对丰度 ＞50％ ＞20％至50％ ＞10％至20％ ≤10％ 允许的相对偏差 ±20％ ±25％ ±30％ ±50％ 空白试验 3 DB34/T 2817—2017 除不加试样外，均按上述步骤进行。 9 结果计算 试样中杆菌肽的含量由色谱数据处理软件或按公式（1）计算获得： X  式中： X —— A —— c —— V —— AS —— m —— A  c V AS  m .................................... (1) 试样中杆菌肽残留量，单位为微克每千克（μg/kg）； 样液中杆菌肽峰面积； 标准工作溶液中杆菌肽的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； 标准工作溶液中杆菌肽面积； 试样的质量，单位为克（kg）； 注：计算结果需将空白值扣除。 10 测定低限、回收率 10.1 方法测定低限 液相色谱串联质谱方法的定量限为 25.0 μg/kg。 10.2 回收率 鸡肉、鸭肉、鸡肝、鸭肝中杆菌肽不同添加水平的平均回收率数据参见附录C。 4 DB34/T 2817—2017 AA 附 录 A （资料性附录） 杆菌肽标准品多反应监测色谱图 图A.1 杆菌肽标准品多反应监测色谱图 5 DB34/T 2817—2017 BB 附 录 B （资料性附录） 液相色谱-串联质谱仪器参数参考条件 监测离子对及电压参数： a) 离子源温度：300℃； b) 干燥气流速：6 L/min； c) 雾化器压力：40 psi； d) 鞘流气温度：350℃； e) 鞘流气流速：12 L/min； f) 毛细管电压: 3.0 kV； g) 碰撞气：氮气； h) 定性离子对、定量离子对、碎裂电压（FP）、碰撞气能量（CE）见表 B.1。 i) 驻留时间：100 ms。 表B.1 FP CE （V） （V） 712.0/199.1 150 50 712.0/227.0 150 37 150 29 定性离子对 712.0/356.2 6 杆菌肽的定性离子对、定量离子对、FP、CE 定量离子对 712.0/199.1 DB34/T 2817—2017 CC 附 录 C （资料性附录） 回收率数据 表C.1 样品名称 鸡肉 鸡肝 回收率数据 添加浓度 回收率范围 （μg /kg） （％） 25 72.2～95.2 100 86.0～109.1 500