ICS  67.120 X 18 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2819—2017 畜禽产品中左旋咪唑残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of levamisole residues in livestock and poultry products-LC-MS/MS method 文稿版次选择 2017 - 03 - 30 发布 安徽省质量技术监督局 2017 - 04 - 30 实施 发 布 DB34/T 2819—2017 前    言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省检验检疫科学技术研究院。 本标准主要起草人：宋伟、吕亚宁、刘宇欣、韩芳、胡艳云、姚杰、周典兵、丁磊、盛旋、郑平。 I DB34/T 2819—2017 畜禽产品中左旋咪唑残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了畜禽产品中左旋咪唑残留量的液相色谱-串联质谱检测方法。 本标准适用于猪肉、猪肝、鸡肉、鸡肝等畜禽产品中左旋咪唑残留量的测定和确证。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法原理 在碱性环境下用乙酸乙酯提取试样中的左旋咪唑残留，用稀盐酸将提取液中左旋咪唑转化为盐酸左 旋咪唑并反萃到盐酸层，强阳离子交换固相萃取柱净化，液相色谱串联质谱法检测，外标法定量。 4 试剂和材料 4.1 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 甲醇：色谱纯。 4.4 乙酸乙酯：色谱纯。 4.5 甲酸：优级纯。 4.6 氢氧化钾：分析纯。 4.7 浓盐酸：分析纯。 4.8 氨水：分析纯。 4.9 氯化钠：分析纯。 4.10 无水硫酸钠：用前在 650℃灼烧 4 h，置于干燥器中冷却后备用。 4.11 0.1％甲酸溶液：去 1 mL 甲酸，用水定容至 1000 mL。 4.12 0.2 mol/L 盐酸溶液：取 18 mL 盐酸（4.6），用水定容至 1000 mL。 4.13 50％氢氧化钾溶液：称取 50 g 氢氧化钾（4.5），用水溶解并定容至 100 mL。 4.14 氨水-甲醇溶液（1+3）：量取 50 mL 氨水（4.7）与 150 mL 甲醇（4.2）混合，摇匀。 4.15 标准品：盐酸左旋咪唑（levamisole hydrochloride，CAS：16595-80-5），纯度大于 98％。 4.16 固相萃取（SPE）柱：强阳离子交换固相萃取柱，3 ml，500 mg，或相当者。使用前依次用 3 mL 甲醇，3 mL 水和 1 mL 0.5 mol/mL 盐酸对柱子进行和活化，保持柱体湿润。 4.17 标准储备溶液的配制：准确称取适量标准品（精确至 0.01 mg），用甲醇（4.2）溶解，配制成 浓度为 1.0 mg/mL 标准贮备溶液，-18℃下避光保存，有效期为半年。 1 DB34/T 2819—2017 4.18 标准中间溶液：吸取 1.00 mL 标准溶液（4.16），移入 100 mL 棕色容量瓶，用水定容，该溶液 浓度为 10 μg/mL。0℃～4℃冰箱保存。 4.19 标准工作溶液：根据需要，吸取适量标准中间溶液（4.17），用流动相稀释成适当浓度的标准工 作溶液，使用前配置。 4.20 滤膜：0.2 μm，有机系。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 6 液相色谱串联四级杆质谱仪或相当者，配电喷雾离子源。 分析天平：感量为 0.01 g。 组织捣碎机。 均质器：10000 r/min。 离心机：转速不低于 8000 r/min。 固相萃取装置：带真空泵。 氮吹浓缩仪。 涡旋混合器。 试样制备与保存 制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化。 从所取全部样品中取出约 500 g，用组织捣碎机充分绞碎均匀，装入洁净容器中，密封，并标明标 记，于 -18℃冰箱冷冻存放。 7 测定步骤 7.1 提取 称取 5 g（精确至 0.01 g）试样， 置于 50 mL 离心管中，加入无水硫酸钠 10 g，1 mL 50％氢 氧化钾溶液和 30 mL 乙酸乙酯，以 10000 r/min 均质 1 min，再以 8000 r/min 离心 5 min，将提取 液转入 50 mL离心管中，然后加入 10 mL 0.5 mol/L 盐酸，振摇 5 min，以 2000 r/min 离心 5 min。 取下层盐酸溶液 10 mL，待净化。 7.2 净化 将 7.1 所得提取液 10 mL 以低于 1.0 ml/min 的流速加载到 SCX 小柱，依次用水 3 mL、0.5 mol/L 盐酸 1 mL 和甲醇 3 mL 淋洗，用氨水-甲醇溶液（4.13）4.0 mL 洗脱，收集洗脱液，在 40℃水浴中 用氮气吹干，用 1.0 mL 流动相溶解，过 0.22 μm 滤膜后，供 LC-MS/MS 分析。 7.3 测定 7.3.1 液相色谱参考条件 条件如下： a) 色谱柱：C18 柱，2.1×50 mm（内径），1.8 μm，或相当者； b) 流动相：乙腈+0.1％甲酸水=20:80（V/V）。 c) 流速：0.3 mL/min。 2 DB34/T 2819—2017 d) e) 7.3.2 柱温：35℃。 进样量：5 μL。 质谱条件 条件如下： a) 离子源：电喷雾离子源（ESI）。 b) 扫描方式：正离子扫描。 c) 检测方式：多反应监测（MRM）。 d) 雾化气、干燥气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵 敏度达到检测要求；详细条件参见附录 B。 e) 毛细管电压、雾化气压力、气帘气压力、辅助气流速、碎裂电压（FP）、碰撞气能量（CE）等 参数应优化至最优灵敏度，参考条件和定性离子对、定量离子见附录 B。 7.3.3 定量测定 取空白样品按照 7.1-7.2 处理，配制适用浓度的基质匹配标准工作液，按浓度由低到高进样检测， 以定量子离子峰面积-浓度作图，得到基质匹配标准曲线。在上述色谱条件下，左旋咪唑参考保留时间 为 0.807 min。其色谱行为见附录A。 待测样液中左旋咪唑的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释至相应范围内再进 样分析。 7.3.4 定性确证 在相同实验条件下，试样中待测物质的保留时间与标准工作溶液中对应的保留时间偏差在 ±2.5％ 之内；且在扣除背景后的试样谱图中，所选择的离子对均出现，同时左旋咪唑定性离子的相对丰度与标 准工作溶液中定性离子的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表1 规定的范围时，则可确定为样品中存 在左旋咪唑残留。 表1 8 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对丰度 ＞50％ ＞20％至 50％ ＞10％至 20％ ≤10％ 允许的相对偏差 ±20％ ±25％ ±30％ ±50％ 空白试验 除不加试样外，均按上述步骤进行。 9 结果计算 试样中左旋咪唑的含量由色谱数据处理软件或按公式（1）计算： X  A  C V AS  m .................................... (1) 式中： X —— 左旋咪唑残留量，单位为微克每千克(μg/kg)； A —— 样液中左旋咪唑峰面积； 3 DB34/T 2819—2017 C —— V —— AS —— m —— 标准工作溶液中左旋咪唑的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)； 样液最终定容体积，单位为毫升(mL)； 标准工作溶液中左旋咪唑面积； 试样的质量，单位为克(g)； 注：计算结果需将空白值扣除。 10 测定低限、回收率和精密度 10.1 方法测定低限 液相色谱串联质谱方法的定量限为 2.5 μg/kg。 10.2 回收率 猪肉、猪肝、鸡肉、鸡肝中左旋咪唑不同添加水平的平均回收率数据参见附录C。 4 DB34/T 2819—2017 AA 附 录 A （资料性附录） 左旋咪唑标准品多反应监测色谱图 图A.1 左旋咪唑标准品多反应监测色谱图 5 DB34/T 2819—2017 BB 附 录 B （资料性附录） 液相色谱-串联质谱仪器参数参考条件 B.1 监测离子对及电压参数 如下： a) 毛细管电压：4000 V； b) 雾化气压力：40 psi； c) 干燥气温度：350℃； d) 干燥气流速：10 L/min； e) 离子源温度：300℃； f) 碰撞气：N2； g) 定性离子对、定量离子对、碎裂电压（FP）、碰撞气能量（CE）见表 B.1。 h) 驻留时间：200 ms。 表B.1 物质名称 左旋咪唑 左旋咪唑的定性离子对、定量离子对、FP、CE 定性离子对 205/91 205/178 定量离子对 205/91 FP CE （V） （V） 126 注：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。 6 40 20 DB34/T 2819—2017 CC 附 录 C （资料性附录） 回收率数据 表C.1 样品名称 猪肉 猪肝 回收率数据 添加浓度 回收率范围 （μg /kg） （％） 2.5 83.6～107.2 5 82.4～101.8 10 94.1～103.9 93.5～109.0 100 95.2～107.5 2.5 69.6～96.4 2.5 88.0～107.2 5 73.6～101.0 5 95.6～108.0 10 77.8～101.9 10 91.8～103.2 100 86.9～107.0 100 97.7～108.6 添加浓度 回收率范围 （μg /kg） （％） 2.5 80.0～110.0 5 84.8～108.6 10 89.7～106.0 100 样品名称 鸡肉 鸡肝 _________________________________ 7