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ICSICS 67.160.10 CCS X 62 团 体 标 准 T/ NAIA 083-2021 葡萄酒中羟基苯甲酸类物质含量的测定 高效液相色谱法 (征求意见稿) 2021-11-03发布 2021-11-10实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 发布TB 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本文件起草单位 :宁夏农产品质量标准与检测技术研究所、宁夏农林科学院、西北农林科技大 学。 本文件主要起草人 :葛谦、李彩虹、孙翔宇、路洁、王晓菁、苟春林、单巧玲、赵银宝、王晓 静、石欣。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 葡萄酒中羟基苯甲酸类物质含量的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了葡萄酒中羟基苯甲酸类物质含量的高效液相色谱测定方法。 本文件适用于葡萄酒中羟基苯甲酸类物质:没食子酸、原儿茶酸、龙胆酸、香草酸、丁香酸 、 原儿茶酸甲酯、香草酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、香草酸乙酯含量的测定。 本文件的方法检出限: 没食子酸的检出限为 0.0580 mg/L,原儿茶酸、 丁香酸的检出限均为 0.0492 mg/L,龙胆酸、对羟基苯甲酸乙酯的检出限均为 0.0530 mg/L,香草酸的检出限为 0.0720 mg/L, 原儿茶酸甲酯、香草酸甲酯、 香草酸乙酯的检出限均为 0.0250 mg/L。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用 文件,仅该日期对应的版本适用本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单 ) 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中的羟基苯甲酸类物质用乙酸乙酯溶剂萃取 ,浓缩至干 ,甲醇定容 ,微孔滤膜过滤 ,高效 液相色谱法测定,外标法定量。 5 试剂与材料 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T 6682规定的一级水。 5.1 甲醇(CH3OH):色谱纯, 5.2 乙酸(CH3COOH):优级纯 5.3 乙酸乙酯( C4H8O2):色谱纯 5.4 没食子酸( Gallic Acid,CAS号149-91-7 )、原儿茶酸( Protocatechuic Acid,CAS号 99-50-3)、龙胆酸( 2,5-Dihydroxybenzoic Acid,CAS号490-79-9 )、香草酸( Vanillic Acid, CAS号121-34-6 )、丁香酸( Syringic Acid,CAS号530-57-4 )、原儿茶酸甲酯( Methyl 3,4-dihydroxybenzoate ,CAS号2150-43-8 )、香草酸甲酯( Methyl Vanillate ,CAS号 3943-74-6 )、对羟基苯甲酸乙酯( Ethyl 4-hydroxybenzoate ,CAS号120-47-8 )、香草酸乙酯 (Vanilicacidethylester ,CAS号617-05-0 )。 5.5 80 %甲醇溶液: 量取80 mL甲醇,用水定容至 100 mL。 5.6 20 %甲醇溶液: 量取20 mL甲醇,用水定容至 100 mL。 全国团体标准信息平台 5.7 羟基苯甲酸类物质单标储备溶液 分别准确称取 100 mg(精准到0.1 mg)没食子酸( Gallic Acid)、原儿茶酸( Protocatechuic Acid)、龙胆酸( 2,5-Dihydroxybenzoic Acid)、香草酸( Vanillic Acid)、丁香酸( Syringic Acid)、原儿茶酸甲酯( Methyl 3,4-dihydroxybenzoate )、香草酸甲酯( Methyl Vanillate )、 香草酸乙酯( Vanilicacidethylester )、对羟基苯甲酸乙酯( Ethyl 4-hydroxybenzoate ),用80 % 甲醇溶液( 5.5)溶解并分别定容至 10 mL容量瓶中, 即为10 mg/mL的单标储备液,于 -20 ℃下, 贮存于密闭的棕色玻璃瓶中。 5.8 羟基苯甲酸类物质混合标准使用液 以80 %甲醇溶液( 5.5)作为溶剂, 将9种羟基苯甲酸类物质单标储备液 稀释配制成 2.0 mg/mL 混合标准使用液。 5.9 0.45μm滤膜,有机相。 6 仪器与设备 6.1 高效液相色谱仪(配紫外检测器) 。 6.2 旋转蒸发仪。 6.3 分析天平:感量为 0.01mg。 6.4 超纯水机。 7 试样的提取 准确吸取 5 mL葡萄酒样品于 50 mL试管中,加入 20 mL乙酸乙酯,转移至分液漏斗中,静置分层 后分液,收集上层有机相,下层水相再次置于分液漏斗中萃取,重复上述操作 3次。合并有机相并 转入蒸馏瓶中,经旋转蒸发仪蒸发至干。残渣溶于 2.5 mL20 %甲醇溶液( 5.6)中,经滤膜 (5.9)过 滤,上机待测。 8 测定 8.1 液相色谱参考条件 色谱柱: Agilent-ZORBAX SB-C18 色谱柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm )或性能相当者。 流动相: A为2%乙酸水; B为乙腈:水(1:1)-0.5%乙酸 ;梯度洗脱, 条件见表 1。 柱温:40 ℃。 检测波长: 280 nm。 进样体积: 10 μL。 流速:0.8 mL/min。 表1 梯度洗脱表 时间/min 流动相A/% 流动相B/% 0 90 10 1 89 11 15 84 16 全国团体标准信息平台 20 45 55 30 40 60 45 90 10 47 90 10 8.2 标准曲线的绘制 取羟基苯甲酸类物质混合标准使用液( 5.8)适量,以 80%甲醇溶液为溶剂, 分别将其稀释成 0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0mg/mL的系列标准 溶液,按8.1进行测定 (色谱图参见附录 A)。以标准溶液质量浓度 (x)为横坐标 ,相应的峰面积 (y)为纵坐标,计算标准曲线或求线性回归方程。 8.3 试样的测定 做两份试样平行测定。 取10 μL试样溶液和相应的标准工作溶液顺序进样,以保留时间定性 , 以色谱峰面积积分值定量 ,依据标准曲线回归方程计算待测液中 9种羟基苯甲酸类物质的浓度 。响 应值应在标准曲线范围内,超过线性范围则应稀释后再进样分析。 8.4 空白试验 除不加试样外,均按上述步骤进行操作。 9 结果计算和表达 试样中没食子酸 、原儿茶酸 、龙胆酸、香草酸、丁香酸、原儿茶酸甲酯 、香草酸甲酯 、对羟基 苯甲酸乙酯、 香草酸乙酯的含量以质量分数 ω计,数值以毫克每升( mg/L)计,按式⑴计算: ………………………… (1) 式中: ρ——标准曲线计算出样液中没食子酸 、原儿茶酸 、龙胆酸、香草酸、丁香酸、原儿茶酸甲酯 、 香草酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、香草酸乙酯的质量浓度,单位为( mg/L); V1 ——样品溶液最终定容体积,单位为毫升( mL); V ——所取试样的质量 ,单位为毫升( mL); 测定结果保留三位有效数字。 10 精密度 在重复性条件下, 获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的 10%。 VV1 全国团体标准信息平台 附 录 A (资料性) 9种羟基苯甲酸类单体酚混合溶液标准色谱图 9种羟基苯甲酸类单体酚混合标准溶液色谱图, 见图A.1。 标引序号说明: 1——没食子酸; 2——原儿茶酸; 3——龙胆酸; 4——香草酸; 5——丁香酸; 6——原儿茶酸甲酯; 7——香草酸甲酯; 8——对羟基苯甲酸乙酯; 9——香草酸乙酯 . 图A.1 9种羟基苯甲酸类单体酚混合标准溶液色谱图 全国团体标准信息平台

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