ICSICS 67.160.10 CCS X 62 团 体 标 准 T/ NAIA 085-2021 葡萄酒中黄烷醇类物质含量的测定 高效液相色谱法 (征求意见稿) 2021-11-03发布 2021-11-10实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 发布TB 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本文件起草单位 ：宁夏农产品质量标准与检测技术研究所、西北农林科技大学、宁夏农林科学 院。 本文件主要起草人：张静、葛谦、闫玥、吴燕、李娴、孙翔宇、赵子丹、刘霞、杨静、牛艳 、 陈翔。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 葡萄酒中黄烷醇类物质含量的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了葡萄酒中黄烷醇类物质含量的高效液相色谱测定方法。 本文件适用于 葡萄酒中黄烷醇类物质 ：表没食子儿茶素 、儿茶酸、表没食子儿茶素没食子酸酯 、 表儿茶酸、表儿茶酸没食子酸酯、杨梅素、异鼠李素含量的测定。 本文件的方法检出限：表没食子儿茶素、儿茶酸 的检出限均为 0.0720 mg/L，表儿茶酸的检出 限均为0.0582 mg/L，表没食子儿茶素没食子酸酯、杨梅素、异鼠李素 的检出限均为 0.0348 mg/L， 表儿茶酸没食子酸酯 的检出限为 0.0214 mg/L。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单 ） 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中的黄烷醇类物质 用75 %甲醇溶液提取 ，涡旋超声 ，微孔滤膜过滤 ，高效液相色谱法测定 ， 外标法定量。 5 试剂与材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯， 水为GB/T 6682规定的一级水。 5.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯， 5.2 乙酸（CH3COOH）：优级纯 5.3 表没食子儿茶素（（ -）-Epigallocatechin ，CAS号970-74-1 ）、儿茶酸（ catechin ，CAS 号7295-85-4 ）、表没食子儿茶素没食子酸酯（（ -）-Epigallocatechin gallate，CAS号 989-51-5 ）、表儿茶酸（Epicatechin ，CAS号490-46-0 ）、表儿茶酸没食子酸酯 （（-）-Epicatechin gallate ，CAS号1257-08-5 ） 、 杨 梅 素 （ Myricetin ，CAS号529-44-2 ） 、 异 鼠 李 素 （Isorhamnetin ，CAS号480-19-3 ）。 5.4 80%甲醇溶液： 量取80ml甲醇，用水定容至 100 mL。 5.5 75%甲醇溶液： 量取75ml甲醇，用水定容至 100 mL。 5.6 黄烷醇类物质单标储备溶液 分别准确称取 100 mg（精准到0.1 mg）表没食子儿茶素（（ -）-Epigallocatechin ）、儿茶酸 全国团体标准信息平台 （catechin ）、表没食子儿茶素没食子酸酯（（ -）-Epigallocatechin gallate）、表儿茶酸 （Epicatechin ）、表儿茶酸没食子酸酯（（ -）-Epicatechin gallate）、杨梅素（ Myricetin ）、 异鼠李素（ Isorhamnetin ），用80 %甲醇溶液（ 5.4）溶解并分别定容至 10 mL容量瓶中， 配置成质 量浓度为 10 mg/mL的单标储备液，于 -20 ℃下，贮存于密闭的棕色玻璃瓶中。 5.7 黄烷醇类物质混合标准使用液 以80 %甲醇溶液（ 5.4）作为溶剂， 将7种黄烷醇类物质单标储备液 稀释配制成 2.0 mg/mL混合 标准使用液。 5.8 0.45μm滤膜，有机相。 6 仪器与设备 6.1 高效液相色谱仪（配紫外检测器） 。 6.2 超声波清洗机。 6.3 涡旋仪。 6.4 分析天平：感量为 0.01mg。 6.5 超纯水机。 7 试样的提取 准确吸取 5 ml葡萄酒样品于 50 ml试管中， 加入20 ml 75 %甲醇溶液（ 5.5），旋涡振荡 1 min 后在室温下超声 30 min，经滤膜（ 5.8）过滤，上机待测。 8 测定 8.1 液相色谱参考条件 色谱柱： Agilent-ZORBAX SB-C18 色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5μm ）或性能相当者。 流动相： A为2%乙酸水； B为5 %乙酸-50 %乙腈水溶液；梯度洗脱， 条件见表 1。 柱温：40 ℃。 检测波长： 280 nm。 进样体积： 10 μL。 流速：0.9 mL/min。 表1 梯度洗脱表 时间/min 流动相A/% 流动相B/% 0 90 10 5 89 11 10 88 12 20 62 38 30 56 44 40 14 86 全国团体标准信息平台 45 90 10 48 90 10 8.2 标准曲线的制作 取黄烷醇类物质混合标准使用液（ 5.7）适量， 以80 %甲醇溶液为溶剂， 分别将其稀释成 0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0mg/mL的系列标准溶液， 按8.1进行测定（ 色谱图参见附录 A）。以标准溶液质量浓度（ x）为横坐标，相应的峰面积（ y） 为纵坐标，计算标准曲线或求线性回归方程。 8.2 试样测定 做两份试样平行测定。 取10 μL试样溶液和相应的标准工作溶液顺序进样，以保留时间定性 ， 以色谱峰面积积分值定量 ，依据标准曲线回归方程计算待测液中 7种黄烷醇类物质的浓度 。响应值 应在标准曲线范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。 8.3 空白试验 除不加试样外，均按上述步骤进行操作。 9 结果计算和表达 试样中表没食子儿茶素 、儿茶酸、表没食子儿茶素没食子酸酯 、表儿茶酸 、表儿茶酸没食子酸 酯、杨梅素、异鼠李素的含量以质量分数ω计，数值以毫克每升（ mg/L）计，按 式⑴计算： ………………………… （1） 式中： ρ ——标准曲线计算出 样液中表没食子儿茶素、儿茶酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿 茶酸、表儿茶酸没食子酸酯、杨梅素、异鼠李素的质量浓度，单位为（ mg/L）； V1 ——样液最终定容体积，单位为毫升（ mL）； V —— 所取试样的质量，单位为 毫升（ml）； 测定结果保留三位有效数字。 10 精密度 在重复性条件下， 获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的 10%。 VV1 全国团体标准信息平台 附 录 A （资料性） 7种黄烷醇类单体酚混合溶液标准色谱图 7种黄烷醇单体酚混合标准溶液色谱图， 见图A.1。 标引序号说明： 1——表没食子儿茶素； 2——儿茶酸； 3——表没食子儿茶素没食子酸酯； 4——表儿茶酸； 5——表儿茶酸没食子酸酯； 6——杨梅素； 7——异鼠李素。 图A.1 7种黄烷醇类单体酚混合标准溶液色谱图 全国团体标准信息平台